邻位连接技术

ProximityLigationAssayproximityligationassay(邻位连接技术,PLA)：一种高灵敏度的蛋白质检测技术。邻位连接技术(proximityligationassay,PLA)被建立。该技术采用核酸适体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针(proximityprobes)。当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时，它们将在空间位置上相互临近，通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测，实现了特殊蛋白质的检测,定量及定位。美国俄亥俄州立大学的研究人员近日开发出一种新技术，能同时观察细胞中的基因数量和蛋白表达。此技术能够详细分析基因状态以及相应蛋白表达之间的关联，并更透彻地了解癌症及其他复杂疾病。该成果发表在《神经肿瘤》（Neuro-Oncology）上。这种新技术称为荧光原位基因蛋白分析（fluorescentinsitugeneproteinassay）。它将传统的荧光原位杂交（FISH）与原位邻位连接分析（insituproximityligationassay，简称PLA）相结合。PLA分析采用核酸适体（aptamer）或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针。当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时，它们将在空间位置上相互临近，通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。文章的作者之一，俄亥俄州立大学的ArnabChakravarti博士表示：“据我所知，这是目前第一个技术，能让我们了解同一细胞中的基因活性和相应蛋白表达。了解肿瘤中的基因和蛋白表达变化，有助于我们了解是什么驱动了肿瘤行为。”文章的通讯作者，亚拉巴马大学副教授MarkusBredel及其同事首先分析了固定的人胶质母细胞瘤细胞，然后分析了石蜡包埋的人胶质母细胞瘤组织。在这两个分析中，他们都发现了一种表皮生长因子受体基因的突变形式（EGFRvIII）的过表达，并在胶质母细胞瘤中发现了截短蛋白。他们认为，这种方法有潜力详细分析细胞和组织中癌基因状态及相应蛋白表达之间的关联。他们表明，荧光原位基因蛋白分析能够在细胞水平分辨癌基因和蛋白，这对于异质性疾病（如癌症）特别重要。因表观遗传学和转录后调控的作用，这种方法对癌症研究很有用。它将基因和蛋白信息相关联，能提高生物标志物筛选的可靠性。它还能辅助治疗决策，因为有时只筛选基因或蛋白产生了不确定的结果。更多阅读《神经肿瘤》发表论文摘要（英文）Gene–proteincorrelationinsinglecellsJaclynJ.Renfrow,AdrienneC.Scheck,NeilS.Dhawan,PaulJ.Lukac,HannesVogel,JamesP.Chandler,JeffreyJ.Raizer,GriffithR.Harsh,ArnabChakravartiandMarkusBredel⇓AbstractWepresentanovelmethodologycombiningtraditionalfluorescentinsituhybridizationwithaninsituproteindetectiontechnologycalledproximityligationassay.Thismethodhaspotentialtoperformadetailedanalysisoftherelationshipbetweengenestatusandcorrespondingproteinexpressionincellsandtissues.Wedemonstratethatthefluorescentinsitugeneproteinassaymethodologyiscapableofresolvinggeneandproteinpatternssimultaneouslyonacell-by-cellbasis.抗体滴度抗体滴度定义用来衡量某种抗体（antibody)识别特定抗原决定部位(epitope)所需要的最低浓度（也即最大稀释度)。一般表示为：仍能产生阳性结果的最大稀释度。通常通过ELISA方法来检测抗原滴度。打个比方，通过间接库姆伯斯试验（indirectCoombstest）检测一个孕妇血清中anti-Rh抗体。一个患者可能报告通过此试验检出的抗体滴度为16，这表示只要血清的稀释度不超过1/16（1份比例的血清和15份比例的稀释液），此试验都能得到阳性结果，即可识别出抗原。如果稀释度超过1/16，则检出的结果皆为阴性，即抗体无法识别抗原。还有可能发生的情况是，几周过后，同样一位患者可能检测出抗体滴度达到32（1份比例的血清和31份比例的稀释液）。这可能是因为孕妇体内产生了更多的anti-Rh抗体，以至于即使更高的稀释度也能得到阳性结果。抗核抗体抗核抗体（antinuclearantibody，ANA）又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮（SLE，95%~100%）、类风湿性关节炎（RA，10%~20%）、混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、干燥综合症（SS,10%~40%）、全身性硬皮病（85%~90%）、狼疮性肝炎（95%~100%）、原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等，但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。抗核抗体在类风湿病人中约有20%～50%IgG型ANA呈阳性，小儿类风湿ANA的阳性率约19%～35%，伴发虹膜睫状体炎者阳性率高（50%~90%），故ANA阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。已发现75%类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）可使白细胞核受到破坏解释抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)抗DNA抗体，（二）抗组蛋白抗体，（三）抗非组蛋白抗体，（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ANA主要存在于IgG，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。抗体分类抗核抗体的分类，由于核抗原不同，有多种不同的ANA。抗DNA抗体抗DNA抗体有抗双链DNA（dsDNA）和抗单链(ssDNA)抗体之分。抗dsDNA抗体与SLE的关系密切，且随疾病的活动度而升降，病情好转者其滴度多下降甚或转阴。抗ssDNA抗体则与抗dsDNA不同，可在多种疾病出现，包括一些非自身免疫性疾病，如细菌和病毒感染。故在临床上无实用价值。而抗dsDNA抗体被认为是红斑狼疮（SLE）所特有。抗DNA的自身抗体在SLE发病中起一定作用。在一些SLE患者，DNA大分子存在于循环中或粘附于多种器官的微血管结构，这些循环或器官原位抗原型DNA均可与循环自身抗体发生反应，形成免疫复合物，激活炎症系统，在一些器官如肾脏，肺和脑组织引起免疫复合物介导的疾病，导致组织损伤。抗可提取的核抗原（extractablenuclearantigen.ENA）抗体此抗体原经盐水或磷酸缓冲液处理，易从胞核中提取出来，且不含DNA。应用免疫荧光技术，抗ENA抗体型染色多呈斑点型。此类抗原分为九种，故产生九种相应抗体。（1）抗核糖核蛋白抗体(antiribonucleoprotein；抗RNP抗体)：抗原来源与SM相同。它对去氧核糖核酸酶不敏感，但对核糖核酸酶，胰酶敏感。1972年把它作为诊断混合性结缔组织病（MCTD）的重要血清学依据。但以后发现本抗体可在多种风湿性疾病出现，不具备对某个病的特异性，但有助于鉴别结缔组织病和非结缔组织病。抗核RNP抗体见于近32%的SLE患者，几乎见于所有MCTD患者。（2）抗SM抗体：SM系一患者Smith的简称。1966年Tan&Kunkel首先在患者Smith体中发现。抗原来源于小牛，兔胸腺，人脾等组织的一种酸性糖蛋白。抗SM抗体可见于1/3或以上的SLE患者，不出现于其他疾病中，对SLE诊断有特异性，成为很有价值的SLE诊断标志，但无此抗体不能排除诊断。（3）抗SS-A抗体：系在发现Sjogren氏综合征（SS）的A抗原后而命名，主要见于SS。本抗原可以从人、牛、猪脾中提取。它除存在核内外，也存在于细胞浆内。对胰酶敏感，对核糖核酸酶抵抗，能耐热（56度）。（4）抗Ha抗体：抗Ha抗体可与小牛胸腺可溶性核提取物(以及小牛和鼠的肝提取物)起反应。见于SS患者,亦称之为SS-B抗体.应用沉淀素反应，补体结合以及荧光技术检测。多数人认为13%SLE及33%SS患者有抗Ha沉淀性抗体。（5）抗PM-1抗体：系多发性肌炎的特异性抗体。抗原系小牛胸腺核提取物，有人暂称之为PM-1。最初有人应用补体结合抑制试验，确定该抗体特性，在皮肌类患者中发现PM-1抗体。有人测定在多发性肌类患者阳性率13.6%，皮肌类（DM）20%，系统性硬化并肌炎25%，SLE并肌炎偶有阳性，在其他疾病和正常人均阴性。说明本抗体对肌炎诊断有一定特异性。（6）抗MA1抗体：为发现抗核酸蛋白抗原的抗体，称之为抗MA1抗体。该抗体只出现于某些严重的SLE患者中。（7）抗Scl-70抗体：因出现在硬皮病且其分子量为70000，故名。抗原为碱性非组蛋白，北京协和医院对系统性硬化用免疫双扩散法测定得抗Scl-70抗体阳性率为60%。在其他结缔组织和非结缔组织病偶有阳性，而正常人均阴性，说明本抗体有较高的特异性，是系统性硬化的标记抗体。（8）抗Jo-1抗体：因患者而命名。国外报道在多发性肌炎（PM）患者阳性率为30-50%，合并有肺间质纤维化的肌炎则达60%，而在皮肌炎（DM）患者则低于10%，在其他疾病均阴性。（9）抗Ku抗体：因患者命名，国外报道本抗体多见于合并有肌炎的系统性硬化患者，阳性率达55%。总之，抗PM-1，抗Jo-1，抗Ku都与肌炎有关。抗组蛋白抗体组蛋白是一组碱性蛋白质，含有稍高量的赖氨酸及精氨酸。是与DNA形成的复合物，结合成DNA一组蛋白。组蛋白抗体见于药物诱发的SLE。国外报道，用免疫荧光三步法测23例药物致狼疮阳性率为96%，12例SLE中42%阳性。北京协和医院以同样方法检测488例服用异烟肼，68例服用苯妥英钠，40例服用复降片（内含肼苯哒嗪），都在服用6个月以上者和另133例服他巴唑3个月以上者，无一例查到本抗体。这种差异可能与我国服用肼苯哒嗪和普鲁卡因酰胺的患者较少之故，也不能除外人种不同而造成的差异。抗着丝点抗体其抗原为紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质。因此需要选择分裂相活跃的细胞作为底物，这种细胞的着丝点较易被暴露。多选用人喉癌上皮细胞（HEP-2），其优点是核大，分裂相多。国外报道本抗体多见于CREST综合征（即表现为软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张）。阳性率达90%以上，称之为CREST的标记抗体。根据协和医院观察测定结果，我国系统性硬化绝大部分是弥散型，CREST型极少见；抗着丝点抗体的阳性率在系统性硬