酵母蔗糖酶的提取方法

酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。1．3酶活性测定适当稀释的酶液0．5mL，加入0．3mLpH4．6、0。1mol／L的NaAc—HAc缓冲液，0．2mL0．1mol／L的蔗糖，37℃准确反应15min，后加0．125mL1mol／L的NaOH中止反应。用DNS法叩在540nm波长下测定形成的还原糖量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖，经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。1．4蛋白质含量的测定按Lowry氏法_1叩测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准，绘制标准曲线。l-5SDS-PAGE分离胶质量分数为12，浓缩胶质量分数为5。1．6等电聚焦用PhastSystem全自动快速水平电泳仪进行等电聚焦电泳。电泳程序的设置参照Amersham公司使用手册。1．7粗酶制备1．7．1甲苯自溶法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水使其溶解，加入2．4gNaAc和4．5mL甲苯，摇床振荡10min，37℃恒温水浴69h。再加入4．8mL4mol／L的HAc和15mL双蒸水，调pH至4．5，于4℃、3000r／min离心30min，离心后将中层清液移出即为粗制酶液，4℃保存。1．7．2冻融法称取酵母10g，加入2OmL双蒸水，置于预先冷却的研钵中，研磨25min，冰箱中冷冻约15min(以研磨内液面上刚出现冻结为宜)，取出再研磨25min，重复以上步骤两次。后置于冰箱中冷冻3h取出，温浴融化，用1mol／L的HAc调pH至5．0，40℃水浴30min，冷却后4℃、12000r／min离心15min，取上清液即为粗制酶液，4℃保存。1.7.3SDS抽提法称取酵母10g，加入60mL0．3mmol／L的SDS溶解，40℃水浴12h后取出，4℃、12000r／min离心15min，取上清液即为粗制酶液，4℃保存。1．8乙醇分级纯化在冻融法和SDS抽提法提取的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4℃放置过夜，4℃12000r／min离心15min，取上清液，再追加乙醇使其终质量分数达50%。4℃放置1h，4℃、12000r／min离心15min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4℃保存。经SDS抽提法提取，质量分数50%的乙醇沉淀所得的酶液对透析液(pH7．3、0．05mol／LTris-HC1缓冲液)充分透析，所得透析液4℃保存。1．9MonoQ阴离子交换柱层析冻融法和SDS抽提法提取的酵母蔗糖酶经上步纯化后，上MonoQ(10／10)阴离子交换柱(用pH7．3、0．05mol／LTris—HC1缓冲液充分平衡过)，然后用0～1mol／L、60min线性梯度的NaC1溶液(内含pH7．3、0．05mol／LTriS-Hcl缓冲液)洗脱。体积流量为0．5mL／min，每管收集3mL，紫外检测波长为280nm。测定各管洗脱液的蔗糖酶活性与蛋白质含量，合并蔗糖酶活力高的若干管洗脱液，经过对水透析脱盐，冷冻干燥后即为纯化的酵母蔗糖酶。2结果2．1提取方法对酵母蔗糖酶活性的影响采用3种方法从酵母中提取蔗糖酶，其活性比较结果见表1。从表中可看出，SDS抽提法的酶活0．2性最高，冻融法次之，常规的甲苯自溶法酶活性最低。表13种提取方法所得酵母蔗糖酶活性比较2．2不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较从表2可以看出，分别用浓度为0．3mmol／L、0．9mmol／L、1．5erotol／L和30mmol／L的SDS提取酵母中的蔗糖酶，当加入0．3mmol／LSDS时，该酶的总活力最大，蛋白量最少，抽提效率最高。表2不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶的比较2．3冻融法和SDS抽提法提取出的酵母蔗糖酶的进一步纯化将冻融法和SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液经质量分数50%的乙醇沉淀，溶解透析后，过MonoQ阴离子交换柱，结果均出现两个峰(见图1、图2)。依洗脱出现的先后顺序分别称为峰I和峰Ⅱ。经酶活性检测和蛋白质含量测定，表明只有峰I具有蔗糖酶活性，而且蔗糖酶活性和酶液的蛋白质含量成正比，为蔗糖酶活性峰。收集MonoQ阴离子交换柱层析后具有较高蔗糖酶活性的峰工的各管洗脱液，冷冻干燥浓缩，得到纯化的酵母蔗糖酶。冻融法与SDS抽提法分别提取纯化出的酵母蔗糖酶的比较结果如表3所示。SDS抽提法提取的蔗糖酶具有较高的酶活性，经质量分数50%的乙醇沉淀后回收率为86．5%。经过MonoQ阴离子交换柱层析后，冻融法和SDS抽提法所得蔗糖酶的纯化倍数分别是相应粗酶液的273倍和150倍，具体结果见表4。图1MonoQ阴离子交换柱层析对冻融法提取的酵母图2MonoQ阴离子交换柱层析对SDS抽提法提取的表3冻融法和SDS抽提法提取纯化的酵母蔗糖酶的比较纯化的酵母蔗糖酶经等电聚焦分析(见图3)，显示为单一条带，由此证明纯化的酵母蔗糖酶是均一的。图3酵母蔗糖酶的等电点测定2．4米氏常数Km的测定用5～20mmol／L的蔗糖在pH4．6、37℃条件下与蔗糖酶作用15min。用双倒数作图法测得酵母蔗糖酶的表观Km值为0．013mol／L(见图4)。图4酵母蔗糖酶的Lineweaver-Burk2．5酵母蔗糖酶等电点和相对分子质量测定经等电聚焦测得酵母蔗糖酶的等电点为5．6(见图3)，SDS-PAGE测得其相对分子质量为60kD(见图5)。3讨论酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法的，冻融法和SDS抽提法报道较少。本实验中比较了上述3种酵母蔗糖酶的提取方法(见表1)，可以看出图5酵母蔗糖酶的SDS-PAGE相对分子质量测定SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的，分别是甲苯自溶法的1120倍和534倍。尽管甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远不如其它两种方法。通过对不同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较，可以看出(见表2)，随着SDS浓度的增加，总蛋白量增大，但酶的总活力增幅较小，比活力也随着SDS浓度的增加逐渐下降。故SDS浓度为0．3mmol／I最适合提取酵母蔗糖酶，可以在保持酶的总活力较高的情况下尽量减少引入杂蛋白，更有利于下一步的纯化。从表3可以看出，SDS抽提法对酵母蔗糖酶的提取效率比较高，是冻融法的2倍，但其中总蛋白量提取也较高，是冻融法的3倍，因此在采用SDS抽提法后，对酵母蔗糖酶的纯化需要去除较多的杂蛋白。分别测定冻融法和SDS抽提法纯化出的酵母蔗糖酶的米氏常数Km，结果基本相同，均为0．013mol／L(见图2)。这一结果与柑叶片、甘薯叶片蔗糖酶相似。测定上述两种方法提取纯化出的酵母蔗糖酶的等电点均为5．6，相比较文献[5]中的结果略高，这可能与酵母的来源和种属有关。从SDS-PAGE实验结果可知，酵母蔗糖酶的相对分子质量为60kD，与文献中报道的相对分子质量相近。4结语综上所述，研究中所用3种提取酵母蔗糖酶的方法都存在优缺点，但从提取效率来看，SDS抽提法最高，还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产。鉴于酵母蔗糖酶在食品工业等方面的巨大应用潜力，目前的各种提取方法仍需进一步改进。[1]陈冰，林轩．蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]．湛江师范学院学报，1997，18(2)：57—60．CHENBing，LINXuan．Studiesonhydrolysisofsucrosebysucrase[J]．JournalofZhanOiangNormalCollege，1997，18(2)：57—60．(inChinese)[2]孙国志，冯惠勇，徐亲民．蔗糖酶提取方法的研究[J]．工艺技术，2002，1(23)：54—55．SUNGuo—zhi，FENGHui—yong，XUQin—min．Studiesonextractingmethodofinvertasefromyeast[J]．ScienceandTech—nologyofFoodIndustry，2002，1(23)：54—55(inChinese)．[3]范业鹏，杜鹏．抗坏血酸对酵母蔗糖酶的激活动力学研究[J]．中国生物化学与分子生物学报，1999，15(1)：98—101．FANYe-peng，DUPeng．Thekineticsofactivationofyeastinvertasebyascorbicacid[J]．ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology，1999，15(1)：98—101．(inChinese)[4]许培雅，邱乐泉．离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究[J]．实验室研究与探索，2002，21(3)：82—84．XUPei—ya，QIULe-quan．StudiesonmethoddevelopmentofinvertaseIonexchangechromatogrampurification[J]．Labo-ratoryResearchandExploration，2002，21(3)：82—84．(inChinese)[5]BelcarzA，GinalskaG，LobarzewskiJ，eta1．Thenovelnon—glycosylatedinvertasefromCandidautilisEJ]．BicohimicaetBiophysicaActa，2002，1594：40—53．[6]FranciscoPChdvez，LuisRodriguez，JoaquinDiaz，eta1．PurificationandcharacterizationofaninvertasefromCandidautilis：comparisionwithnaturalandrecombinantyeastinvertases[J]．JournalofBiotechnology，1997：67—74