酶工程上海师范大学

酶基本知识酶生产技术酶改性技术应用技术研究进展选择20/20填空24/24简答30/5综合16/2论述10《酶工程》教案汇编1、酶的催化作用特点：具有专一性强；催化效率高和反应条件温和等显著特点。2、酶研究的两个方向：理论研究方向和应用研究方向。理论研究方向：酶的理化性质、催化性质、催化机制等；应用研究：促进了酶工程的形成。3、酶工程定义：利用酶或者微生物细胞、动植物细胞，细胞器，借助于酶的催化作用，通过工程学手段生产产品或提供社会服务的科学体系。4、酶工程的应用范围：对生物资源中天然酶的开发和生产；自然酶的分离纯化与鉴定技术；酶的固定化技术（酶和细胞）；酶反应器的研制与应用；与其它生物技术领域的交叉与渗透。5、酶工程的组成：酶的发酵生产，酶的分离纯化，酶分子修饰，酶和细胞固定化，酶反应器和酶的应用等方面。6、酶工程的主要任务：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。7、酶工程研究简史1878年德国人库尼(Kuhne)首先把这种物质称之为酶(Enzyme)，这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中”。1896年德国巴克纳兄弟(Buchner)发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。他们把这种物质称为酒化酶（eymase）。一般认为酶学研究始于1896年。1913年，米彻利斯(Michaelis)和曼吞(Menten)提出中间产物学说，推导出酶促反应的基本方程式——米氏方程。这一学说的提出，对酶反应机理的研究是一个重要突破。Km是酶的特征性动力学参数。物理含义：是指ES复合物消失速度（K2+K3）与形成速度(K1)之比；其数值为酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。V＝Vm/2时[S]＝Km。Km只与酶结构、底物、反应环境有关，与[E]无关。大多数酶Km值在10-2—10-6mol/L范围内。意义：鉴别酶的最适底物；判断在细胞内酶的活性是否受底物抑制；判定酶催化的优势方向及其代谢过程的限速步骤；发现同工酶及其判定抑制作用的类型。1926年，萨姆纳(Sumner)首次从刀豆提取液中分离得到脲酶结晶，证明它具有蛋白质的性质，提出酶的化学本质是蛋白质的观点。但该观点多年以后才被普遍接受。并于1949年得诺贝尔奖。20世纪50-60年代，Koshland提出“诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性；Monod提出“变构模型”定量地解释了某些酶的活性可以通过结合小分子（效应物）进行调节，产生了酶的调控技术。1949年，用液体深层培养法进行细菌a-淀粉酶的发酵生产，撂开了近代酶工业的序幕。50年代以后，随着生化工程的发展，大多数酶制剂的生产巳转向微生物液体深层发酵的方法。由于微生物种类繁多，生长繁殖迅速，可在任何季节、任何地理环境下进行生产。这就使酶的生产大规模地发展。1960年，法国的雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制。使酶的生物合成可以按照人们的意愿加以调节控制。通过酶的诱导和解除阻遏，可以显著地提高酶的产量。8、酶的分类：1961年国际生化联合会酶学委员会提出将酶分成6大类。即第1类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；第6类，合成酶(，或称连接酶)，第7类核酸类酶。9、酶的作用机制：酶的催化机理可能与几种因素有关：酶与底物结合时，两者构象的改变使它们互相楔合，底物分子适当地向酶分子活性中心靠近，并且趋向于酶的催化部位，使活性中心这一局部地区的底物浓度大大增高，并使底物分子发生扭曲，易于断裂。在另一些情况中，可能还有一些其他的因素使酶反应速度稍有一些增高，如酶与底物形成有一定稳定度的过渡态中间物——共价的ES中间物，这种ES中间物又可迅速地分解成产物；又如酶活性中心的质子供体和质子受体对底物分子进行了广义的酸碱催化等。10、酶的催化能力：酶仅能改变化学反应的速度，并不能改变化学反应的平衡点。酶本身在反应前后也不发生变化。例如肽键遇水自发地进行水解的反应极为缓慢，当有蛋白酶存在时，这个反应则进行得十分迅速；可降低反应的活化能。在一个化学反应体系中，反应开始时，反应物(S)分子的平均能量水平较低，为“初态”(initialststate)(A)。在反应的任何一瞬间反应物中都有一部分分子具有了比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能(activationenergy)，使这些分子进入“过渡态”(transitionstate)(即活化态，A*)，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质——产物(P)。即S变为P。这些具有较高能量、处于活化态的分子称为活化分子；反应物中这种活化分子愈多，反应速度就愈快。活化能的定义是在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能(freeenergy)，单位是焦耳／摩尔。11、酶的专一性：如果没有酶的专一性，在细胞中有秩序的物质代谢将不复存在，而且酶的应用将如同其他非酶催化剂那样受到局限。酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。酶的专一性可以按其严格程度的不同，分为下列两大类：结构专一性（1）绝对专一性一种酶只能催化一种物质进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。如：脲酶只分解尿素。（2）相对专一性一种酶能够催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。分基团专一性和键专一性。如：α-D-葡萄糖苷酶要求α-糖苷键的一端必须有葡萄糖残基，即α糖苷键，而对另一端R基团则要求不严。因而它可催化蔗糖、麦芽糖水解。但不能β-能葡萄糖苷键。如，胰蛋白酶（EC3．4，31．4）选择性地水解含有赖氨酸或精氨酸的羰基的键。故此，凡是含有赖氨酸或精氨酸羰基的酰胺、酯和肽都能被该酶迅速地水解。立体异构专一性：（1）旋光异构专一性：如L-氨基酸氧化酶，只作用L型，对D型无作用。（2）几何异构专一性：如：延胡索酸水化酶，只催化反-丁烯二酸合成苹果酸，或基逆反应；而不能催化顺-丁烯二酸，也不能催化逆反应生成顺-丁烯二酸。酶的专一性的确定：确定某种酶的专一性几个步骤：首先要选择一种该酶可催化的物质作为该酶的作用底物，通过试验确定其最适的pH值、温度等反应条件；其次是试验底物浓度对反应速度的影响，确定其米氏常数Km；然后用其他有可能是该酶作用底物的物质，在相同的条件下逐个进行试验，有时要在不同的条件下逐个试验，观察是否有催化反应发生，从而确定该酶是属于绝对专一性还是相对专一牲，对于相对专一性的酶，可作用于一类物质，可以选择几种有代表性的底物，求出各自的值。在某些情况下，不同的底物有不同的最适pH值，而pH值对Km有一定的影响。此时必须作出不同底物各自的pH曲线。然后再在各自的最适pH值条件下进行试验，以确定各底物相应的Km值。在进行酶的专一性试验时，所使用的酶和各种底物都要尽可能地纯。对于有不对称碳原子的物质，应分别对不同的光学异构体进行试验。12、酶活的可调节性：酶活性调节的几种方式：酶浓度的调节（诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解）；激素调节；共价修饰调节；限制性蛋白水解；抑制剂调节；反馈调节；金属离子和其它小分子调节。P14几种调节机理：别构效应的调控、可逆共价修饰调控、酶原的激活、激促蛋白质或抑制蛋白质的调控。酶抑制剂可以使酶失活，但它并不明显改变酶的结构，酶尚未变性，去除抑制剂后酶活性又可以恢复。失活是酶活性的抑制或是永久性的变性失活。抑制作用分为可逆性与不可逆性等2种类型。13、酶活力单位酶活力的高低，是以酶活力单位数来表示的。为此，需首先对酶的活力单位下一个确切的定义。1961年，国际生物化学联合会规定：在特定条件下(温度可采用25℃或其他选用的温度；pH等条件均采用最适条件)，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个活力单位。为了比较酶制剂的纯度和活力的高低，常常采用比活力这一概念。酶的比活力是指在特定的条件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数。即：酶比活力=酶活力(单位)／mg酶蛋白，有时也采用每1(m)L酶液或每g．酶制剂的活力单位数表示酶的比活力。14、酶的生产方法：提取法、、发酵法、化学合成法。15、酶生物合成的基本过程：RNA的生物合成；翻译：肽链合成的起始；肽链的延长；肽链合成的终止：随着肽链的延伸，mRNA与70s核糖体不断地作相对移动。当mRNA分子中的终止密码子(UAA，UAG，UGA)移动到核糖体的A位时，没有相应的氨酰-tRNA进入，此时释放因子(ReleaseFactor)进入A位，并与终止密码子结合。据研究表明，释放因子有两种，其中RF-1可与UAA和UAG结合，而RF-2可与UAA和UGA结合。在释放因子进入A位后，已合成的完整肽链从P位转至A位时，被释放出来。随之?0s核糖体解离成为30s亚基和50s亚基，可重新用于下一次肽链的合成。新合成的肽链释放出来后，还需经过加工才能形成完整空间结构的酶或蛋白质。加工过程首先需经过肽脱甲酰酶的作用，使甲酰甲硫氨酸残基上的甲酰基除去。有时还需在氨肽酶的作用下从肽链的N-末端切除一个或数个氨基酸残基，然后自动折迭耄曲成完整的空间结构。16、酶生物合成的调节：转录水平的调节控制，又称为基因的调节控制。这种控制理论最早是由雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)于1960年提出的操纵子学说来阐明的，基因对酶生物合成的调节控制有3种模式。即分解代谢物阻遏作用，酶合成的诱导作用以及酶合成的反馈阻遏作用。17、酶的生产菌种要求：1、酶的产量高，酶的性质应符合使用要求，而且最好是胞外酶生产菌；2、酶的产量高发酵周期短，培养条件易控制；3、菌种产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；4、酶产物易分离纯化，回收率高；5、不是致病菌，在系统发育上，最好与病原体无关，不产毒素。18、常用产酶微生物枯草杆菌：淀粉酶、蛋白酶；巨大芽孢杆菌：葡萄糖异构酶；大肠杆菌：一般分泌胞内酶，如：谷氨酸脱羧酶、青霉素酰化酶等。啤酒酵母：转化酶、醇脱氢酶；假丝酵母：脂肪酶、转化酶；黑曲酶：果胶酶、酸性蛋白酶、糖化酶；根霉：糖化酶、转化酶；毛霉菌：蛋白酶、糖化酶、脂肪酶；青霉：纤维素酶、葡萄糖氧化酶；米曲霉：糖化酶、蛋白酶；链霉菌：青霉素酰化酶、碱性蛋白酶、几丁质酶。8、酶的合成类型9、酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。10、同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。11、延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA相对稳定。12、中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。13、滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。其对应的mRNA稳定性高。14、其中最理想的合成模式是延续合成型。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。mRNA稳定性好的，平衡期以后继续合成酶；不受阻遏物影响；生产中，最理想的合成模式应是延续合成型。15、同步合成型要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；滞后合成型要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；16、中期合成型则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成