酶样品测定方法

酶样品待测酶液制备方法磷酸缓冲液的制备中性蛋白酶（pH=7.5）准确称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水定容至1000ml，配好后用pH计校正。淀粉酶（pH=6）称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解并定容于1000ml，配好后用pH计校正。脂肪酶（pH=7.5）称取磷酸二氢钾1.96g，十二水磷酸氢二钠39.62g，用水溶解并定容于500ml，配好后用pH计校正。酶液的制备称取样品1.000g至10ml试管中，加入磷酸缓冲液5ml，置于高速匀浆机捣碎，然后连残渣一起倒入100ml容量瓶中定容，室温静置1h，期间反复震荡3次，然后取4ml在16000r/min下离心5分钟，取上清液4℃保存待测。酶活测定淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶采用建成生物工程研究所试剂盒测定，中性蛋白酶采用福林酚法测定。淀粉酶原理：淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出淀粉酶的活力。单位定义：在37℃、pH6.0下，与底物作用30分钟，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。分析方法：试剂：0.4mg/ml底物缓冲液，0.01mol/L碘应用液。测定管空白管底物缓冲液ml0.50.5待测样本ml0.1混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟。碘应用液0.50.5蒸馏水3.03.1混匀，660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度。计算：酶活力（U/g）=(空白管吸光度-测定管吸光度)/空白管吸光度×(0.4×0.5/10)×(30分钟/7.5分钟)÷（取样量×酶液浓度）脂肪酶原理：甘油三酯和水制成乳化液，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊性状，胶束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下发生水解，使胶束分裂，散射光或浊度因而降低，降低的速率与脂肪酶活力有关。单位定义：在37℃条件下，在反应体系中与底物反应1分钟，每消耗lμmol底物为1个脂肪酶活力单位。分析方法：1、将分光光度计在420nm处以Tris缓冲液调零。2、将底物缓冲液在37℃预温5分钟。3、在试管中加入0.025ml待测样本，再加入试剂四0.025ml，然后加入4ml预温的底物缓冲液，盖住管口，颠倒混合5次，在420nm处比浊，读取吸光度值A1。4、将比色液倒入原试管中置37℃准确水浴10分钟，再比色读取吸光度值A2，求出两次吸光度差值（A1-A2）。标准管吸光度的计算：取底物缓冲液4ml加0.9%氯化钠50μL，420nm比浊，读取吸光度AS值，相当于标准管（454μmol/L）的浓度的吸光度值。计算：酶活力（U/g）=(A1-A2)/AS×454μmol/L×测定管底物毫升数(4)/样本毫升数(0.025)÷反应时间（10）÷酶液浓度(10g/L)中性蛋白酶原理：磷钨酸和磷钼酸的混合物，即福林试剂，在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钼蓝和钨蓝混合物）。蛋白质或水解物中含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸等），用蛋白酶分解酪蛋白（底物）。生成含酚基的氨基酸与福林试剂显蓝反应，可从蓝色的深浅测知酶活力的多少。单位定义：在pH7.5、40℃条件下，每分钟水解酪素产生相当于1μg酪氨酸所需的酶量，规定为一个酶活力单位。分析方法：L-酪氨酸标准液配制：表1L-酪氨酸标准液配制管号酪氨酸标准溶液浓度（µg/ml）取100µg/ml酪氨酸标准溶液的体积ml取水的体积ml000512014240233603248041510050分别取上述溶液各1.00ml（平行实验），各加入0.4mol/L的碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂使用溶液1.00ml，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此曲线通过零点）。酶活测定：先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水裕中，预热5min。取4支试管，各加入1ml酶液。取2支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他2管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min。然后取出试管，2支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。静置10min，离心（6000r/min）5分钟，各取1ml上清液，分别加0.4mol/L的Na2CO35ml，福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。计算：酶活力（U/g）＝4/10×K×N式中：K—从标准曲线中查得的OD值相对应的酪氨酸μg数。N—稀释倍数。4为反应液总体积（mL），10为反应时间（min）。胰蛋白酶原理：胰蛋白酶能催化水解底物精氨酸乙酯的酯链，使其在253nm处吸光度值升高，根据吸光度的变化可以计算出胰蛋白酶的活力。单位定义：在pH8.0、37℃条件下，胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003为1个酶活力单位。分析方法：试剂名称空白测定底物应用液ml1.51.537℃预温5分钟样本ml0.015试剂二ml0.015加入样本的同时开始计时，混匀后，倒入0.5cm光径的石英比色皿中，于253nm处测定吸光度，记下30秒时的吸光度值A1；将比色皿中的反应液倒入原试管中，放入37℃水浴20分钟，于20分30秒时记录吸光度A2。计算：酶活力（U/g）＝[测定（A1-A2）—空白（A1-A2）]/(20分钟×0.003)×1.515/0.015÷（取样量ml×酶液浓度）