连续温度变化对葡聚糖酶酶解酵母葡聚糖的影响

连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响摘要:为了探索反应温度对产物组分的影响，利用自制连续变化的温度梯度实验装置，研究了22℃~60℃(±0.1℃)区间内温度对一内切β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响，获得了酶解过程多点温度特性数据。分析表明：该酶酶解酵母β-葡聚糖的活化能为84.17kJ/mol；以产物积累表示的最适酶解温度随时间延长呈指数下降；酶解产物组分受温度的影响，低温较高温获得的寡糖链长，高温区大于46℃可以获得以昆布二糖、昆布三糖为主的组分，而低温区小于30℃可以获得昆布五糖及更大分子量的产物。研究结果可为寡糖生产提供精确的温度控制参数。关键词:温度梯度，β-1,3-葡聚糖酶，水解，β-1,3-D-葡寡糖Effectofcontinuoustemperaturechangeonhydrolyticproductsofyeastβ-glucanbyendo-β-1,3-glucanaseAbstract:Inordertoexploretheinfluenceofreactiontemperatureontheproductcomposition,theeffectofcontinuoustemperaturechange(22°C−60°C,±0.1°C)onhydrolysisofyeastβ-glucanbyendo-β-1,3-glucanasewasdeterminedbyusingself-developedBiochem-temperatureCharacteristicApparatus.Theactivationenergyofenzymatichydrolysisofyeastβ-glucanwas84.17kJ/mol.Theoptimumtemperaturerepresentedbyaccumulationofproductsdecreasedexponentiallywithinacertainperiodoftime.Thecomponentsoftheproductswerechangedwithreactiontemperature.Thelengthofoligosaccharidesdecreasedwiththeincreaseoftemperature.Themainproductswerelaminaribioseandlaminaritrioseatthetemperaturehigherthan46°C,whilethemainproductswerelaminaripentaoseandlargermolecularweightcomponentsatthetemperaturelowerthan30°C.Theresultscanprovidepreciseparameterstocontrolthereactiontemperatureoftheproductionof1,3-β-D-glucooligosaccharides.段峰等:连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响1093Journals.im.ac.cnKeywords:temperaturegradient,endo-β-1,3-glucanase,hydrolysis,1,3-β-D-glucooligosaccrides温度是生命环境的重要因素之一，是生命科学研究工作中必须控制的首要条件。研究温度对生命体生长繁殖的影响，以及温度对生物酶反应的效率等是生命科学研究领域中的一个关键内容。目前实验室所用恒温装置主要是空气浴、水浴形式，对温度的控制为一室一控。在一个恒温装置中进行一次实验只能获得一个温度点的特性数据，欲完成一条温度特性曲线的完善描述，还需要多次实验才能完成，由于多次实验要受到环境条件、仪器稳定性、试剂配制、操作手法等不确定性因素干扰，所得各温度点的数据不适合温度特性研究工作。综观已报道的温度对微生物生长和产物形成过程分析的报告，都是依据上述温度梯度试验结果而作出的，通常都是相隔5℃和温差±1℃下得到的，由此可见一个确切的温度影响的动力学过程是难以得到的，特别是对于“转折点”的判断会造成显著误差，而这又是微生物生理学和生物工程学上的重要参数。早在1958年，Halldal和French开始利用金属铝板产生温度梯度，在其上铺琼脂介质支持海藻生长，并利用水槽、毛玻璃、纸梳形成光照梯度，进行温度与光照两个因素对海藻生长影响的研究[1]。后来有许多研究者改进或自行设计新型温度梯度装置进行温度特性的相关研究工作。Thompson利用自制“温度梯度栅”研究了温度对野生植物种子的发芽影响与其对自身生长环境适应性的关系[2]；Blankley等利用灯泡为热源，冷端暴露等设计了一种简易的温度梯度产生装置，研究了温度对卡氏球钙板藻Cricosphaeracarterae生长的影响[3]；Youdeowei采用金属铜片作为温度梯度产生介质，研究了红蝽Dysdercusintermedius的温度适应行为[4]；Clark等设计了一种不连续温度梯度小室装置，研究了细胞生长与病毒复制的温度特性[5]；Battley在前人设计基础上，改进并研究了连续温度梯度下微生物生长的最大、最适、最低生长温度，解决了非连续梯度实验中个别的适应性生长现象给判定生长温度极限带来的误差[6]；Siver改进了培养海藻的装置，使其可产生较大范围的温度梯度[7]。近些年，出现了一些较为特别的改进。Wolf等设计了微型化、稳定线性化的温度梯度装置[8]；Mao等设计了一种可控微流多通道的线性温度梯度装置，可广泛用于研究催化反应活化能、熔点、荧光量子产生曲线等[9]；Grodzicki等在传统温度梯度装置上加装红外线探测器，并接入计算机实时记录，研究了蜜蜂和蟑螂适应温度个体和群体表现行为的差异[10]。另外还有许多采用相似温度梯度装置进行研究的报道[11-15]。作者依据金属板能产生连续温度梯度的特性与生物温度特性研究工作的需要，设计了具有连续温度梯度板面和等间隔温度梯度孔等的实验装置，可在温度梯度孔中放置2×20个实验管，可一次获取20个梯度温度点的特性数据，足以精确描绘温度特性曲线，可广泛应用于微生物液固培养、生物酶反应、植物种子发芽、昆虫繁育等相关生物技术领域的温度特性研究。β-1,3-葡寡糖是重要的功能性糖，可作为植物抗真菌病害免疫促进剂，也有抗糖尿病活性[16]，还可诱导人血细胞产生抗肿瘤因子[17]等。本室研究获得一株壳聚糖酶产生菌MitsuariachitosanitabidaH12(CGMCC2949)，研究发现其产生一种内切型β-1,3-葡聚糖酶，可用来制备β-1,3-葡寡糖，并发现温度是影响水解产物组分的重要因素，对其不同温度下的酶解进一步研究有望获得大分子产物，扩大该酶的应用领域。本文利用生化温度特性实验仪详细研究了温度对该酶酶解酵母β-葡聚糖过程的影响，求出了反应活化能、温度衰减方程、产物组分变化等。1材料与方法1.1供试菌株与β-1,3-葡聚糖酶MitsuariachitosanitabidaH12，由山东大学微生1094ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechJuly25,2011Vol.27No.7Journals.im.ac.cn物国家重点实验室提供；经由液体发酵、离心获得上清、硫酸铵盐析获得粗酶，该粗酶经分离纯化为单一内切型β-1,3-葡聚糖酶，其最适反应温度和pH分别为52℃和5.2。1.2主要仪器与试剂温度梯度产生装置为自制生化温度特性实验仪(专利号：201020015088.1)，示意图见图1。该仪器通过在金属铝板两端分别加热和制冷形成线性温度梯度，并具有20个等温差梯度孔和连续的温度梯度板面，温度波动范围小于±0.1℃，设计高端极限95℃，低端极限−2℃，最大温差60℃。利用等温差梯度孔进行固体试验时采用普通试管；液体试验时采用“L”型试管，封闭端插入试验孔中，开口端向上，温度梯度板以图1“C”为中轴作弧形往复转动，则试验液体在管中作往复流动。利用连续温度梯度板面进行试验时可采用普通平皿。β-葡聚糖购于安琪酵母有限公司，β-葡聚糖含量70％；昆布二糖、昆布五糖购于SeikagakuKogyo(Japan)；昆布三糖、昆布四糖购于Sigma-Aldrich(USA)；其他试剂为分析纯，水为去离子水。1.3β-葡聚糖的酶解方法将β-葡聚糖和0.2mol/L乙酸缓冲液(pH5.2)以3.5∶100(W/V)的比例混匀后，121℃灭菌30min，趁热磁力搅拌并自然冷却。每支“L”型试管分装9.00mL，插入试验孔(图1B所示)中并转动梯度板进行预热15min，分别加入1.00mL酶液，在设定时间点取样，每次取样200μL，加入含800μL无水乙醇的1.5mL离心管中，混匀终止反应，10000r/min离心5min，取上清备用。1.4酶解产物的分析1.4.1酶解产物的还原糖分析采用DNS法测定[18]：取400μL适当稀释后的样品加入DNS试剂400μL，沸水浴10min，立即冷却，取200μL加入96孔板，并于酶标仪(Victor3TMV，PEcompany，USA)上550nm读数，以葡萄糖为标准还原糖当量计算还原糖浓度。图1生化温度特性实验仪主要组成部件示意图Fig.1DiagramofBiochem-temperatureCharacteristicApparatus.Oneendofaluminumboardcontainscartridgeheaters(E),andtheotherendisconnectedtothecirculatingcoolingdevice.Temperatureismonitoredbyadjacentthermistor.Thepump(D),tank,refrigerator,temperaturecontroller,motor,andalltheothercomponentsoftheapparatusareplacedinchassisexceptthealuminumboardwhichwassupportedbybracket.段峰等:连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响1095Journals.im.ac.cn1.4.2酶解产物的组分分析酶解产物寡糖组成由薄层色谱(TLC)进行分析，薄层板采用TLC-60plate(MerckTLCSilicagel60F254)，点样采用半自动电动点样仪(上海科哲生化科技有限公司)，展层剂为乙酸乙酯∶乙酸∶水=2∶2∶1(V∶V∶V)，显色条件为10％(V/V)硫酸-乙醇溶液喷雾后130℃加热10min[19]。1.4.3酶解产物的纯化酶解液经离心获得上清，减压蒸发至折光10％~15％，加入1％活性炭于70℃保温30min脱色，脱色液进行活性炭柱层析分离[20]，洗脱液为水∶乙醇(V/V)=1∶3，洗脱液经减压蒸发除掉乙醇，冷冻干燥后为纯化的酶解产物样品。2结果与分析2.1温度对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响对于生物酶酶解反应来说，一般是温度升高则反应速度提高，在长时间酶解反应过程中，过高的温度可提高初始速度但加速酶的失活，不利于产物的积累，而较低的温度有利于酶的稳定。利用生化温度特性实验仪，在22℃~60℃范围内以2℃为间距的20个等温差实验点，进行了酶解实验，研究了温度对该酶酶解酵母β-葡聚糖反应过程的影响。图2为采用Interpolant函数(MATLABR2009bsftool)以温度和时间对产物浓度作图。从图2上的不对称可以得出，随水解时间的延长，产物积累最大的温度并不是一成不变的，而是略微下降的。即酶解反应开始1h内，最大产物积累接近50℃，而9h则下降到40℃附近。通过对每个采样时间点的数据进行Gaussian函数平滑(MATLABR2009bcftool)，并获得最大值对应