紫杉醇的生产工艺

第七章7.4紫杉醇的生产工艺7.4.1概述紫杉醇（Paclitaxel，Taxol®，图1），最早是由美国化学家Wani和Wall于1971年从太平洋红豆杉的树皮中提取到的一种具有抗肿瘤活性的物质。它具有独特的抗癌机制，其作用位点为有丝分裂和细胞周期中至关重要的微管蛋白。紫杉醇能促进微管蛋白聚合而形成稳定的微管，并抑制微管的解聚，从而抑制了细胞的有丝分裂，最终导致癌细胞的死亡。紫杉醇1992年12月被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌。1994年，批准用于治疗转移性乳腺癌，1997年FDA批准使用紫杉醇治疗爱滋病关联的Kaposi's恶性肿瘤；1998年和1999年，FDA又分别批准半合成紫杉醇与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。紫杉醇是近几年国际公认的疗效确切的重要的抗肿瘤药物之一。-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-,13,7,4,2,20-环氧-1紫杉醇具有复杂的化学结构，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式C47H51NO14，分子量853.92，元素百分比C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。化学名：5[(2′R,3′S)-N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯]紫杉醇的来源最初以天然提取为主，主要是从由红豆杉属植物的树皮中分离得到。红豆杉植物是生长极为缓慢的乔木或灌木，其树皮中紫杉醇的含量平均为万分之一点五，从中提取紫杉醇的收率大约为万分之一，这样制取1kg紫杉醇就需树皮10吨，这种生产紫杉醇的方法严重破坏资源和环境。目前，包括我国在内的许多国家都已经禁止或严格限制用这种方法来生产紫杉醇。为解决紫杉醇的大量供应问题，人们曾探索通过组织和细胞培养、化学合成等方法制取紫杉醇。其中，化学合成是人们首先想到的解决紫杉醇药源问题的一条途径。这里的化学合成又有全合成和半合成之分。如前所述，紫杉醇的分子结构十分复杂，分子中有众多的功能基团和立体化学特征，如此复杂的结构堪称是对化学合成的一个挑战。1994年，紫杉醇的全合成在实验室获得成功[1，2]。到目前为止，文献报道的紫杉醇的全合成路线共有3条，即1994年由Holton和Nicolaou研究组几乎同时完成的2条路线以及1996年Danishefsky小组报道的路线。紫杉醇的全合成中，反应步骤多达20—25步，大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本昂贵，虽然具有重要的理论意义，但不适合大规模工业生产。为了避免合成紫杉醇复杂的母环部分，人们探索了半合成的制备方法。研究发现，红豆杉植物中除紫杉醇外，还有大量母环结构与紫杉醇类似的化合物，其中，最重要的是巴卡亭Ⅲ（BaccatinⅢ）和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10－DeacetylbaccatinⅢ，10－DAB）（图2）。从它们出发，可以通过半合成方法来生产紫杉醇。紫杉醇的半合成过程，就是以天然存在的紫杉醇母环结构类似物巴卡亭Ⅲ和10-DAB为基本原料，在其C-13位接上化学合成的侧链，以此制备紫杉醇的方法。该方法避开了复杂的紫杉醇二萜部分的合成，过程简明，便于实现规模化生产。10-DAB和巴卡亭Ⅲ在红豆杉植物中的含量比紫杉醇丰富得多，分离提取也相对容易，而且树叶的反复提取也不会影响植物资源的再生，因此，从目前来看，半合成是最具实用价值的制备紫杉醇的方法。通过半合成研究，还可以获得有关紫杉醇类似物构效关系的信息，对紫杉醇进行结构改性以寻找活性更大、毒副作用更小，抗癌谱更广或略有不同的紫杉醇类抗癌药物。多烯紫杉醇（Docetaxel，Taxotere®，图3）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3位上的取代基略有不同。1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-PoulencRorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目前多烯紫杉醇主要由AVENTIS公司（法国罗纳普朗克乐安公司与德国赫斯特合并后的新公司）生产，已在多个国家上市使用。多烯紫杉醇与紫杉醇有相同的作用机制，是紫杉醇家族第二代抗癌新药的代表，它抑制微管解聚、促进微管二聚体聚合成微管的能力是紫杉醇的两倍。多烯紫杉醇的IC50值（肿瘤细胞存活减少50%）范围为4-35ng•mL-1。体外抗肿瘤活性实验已证实，多烯紫杉醇对某些类型肿瘤细胞的抑制活性克达紫杉醇的10倍。此外，多烯紫杉醇还具有较好的生物利用度，更高的细胞内浓度，更长的细胞内潴留时间等。多烯紫杉醇的研究与应用也十分有价值。紫杉醇和多烯紫杉醇结构十分相似，所以紫杉醇的半合成工艺适当调整后也适用于合成多烯紫杉醇。7.4.2原料制备紫杉醇分子由一个二萜母环和一个苯基异丝氨酸侧链组成，因此半合成紫杉醇的原料分为母环和侧链两部分。大量的关于紫杉醇结构—活性关系的研究表明，紫杉醇二萜母环上C-4，C-5位的环氧丙烷环、C-2位的苯甲酰氧基、C-4位的乙酰氧基、C-7、C-9、C-10位的基团、C-11和C-12间的双键、C-13侧链基团及其（2′R，3′S）构型对于维持紫杉醇的活性至关重要。同时，保持紫杉醇骨架的完整，保证上述基团在空间上排列的稳定性，对于紫杉醇的活性也是必不可少的。在半合成过程中，紫杉醇二萜母环上的基团及其立体化学特征可以完全来自于原料巴卡亭Ⅲ和10-DAB，这样，紫杉醇的半合成过程实际上归结为在二萜环上连接具有活性结构的苯基异丝氨酸侧链的问题。半合成紫杉醇的侧链大致分为非手性侧链、手性侧链和侧链前体物三大类。1.非手性侧链这类侧链与紫杉醇的侧链有一定的差别，主要是没有立体化学特征，常用的是一些肉桂酸类化合物如反式的肉桂酸（图4）等。利用非手性侧链合成紫杉醇时，先把侧链连接到二萜母环上，然后进行立体控制的化学反应，产生紫杉醇的手性侧链结构，典型例子是肉桂酸成酯法[3]。反应以环己基碳二亚胺（DCC）做缩合剂，4－二甲基氨基吡啶（DMAP）为催化剂，将肉桂酸与保护后的母环7－(2,2,2－三氯-)-巴卡亭Ⅲ乙酯进行反应，然后对侧链上的双键进行羟基化、氨基化、苯甲酰化处理，产生所需要的立体构型，去除保护基后得到几种非对映体的混合物，通过薄层层析（TLC）得到各种纯化的异构体。这种半合成的方法主要缺点是产生紫杉醇的活性侧链结构时选择性较差。2.手性侧链半合成紫杉醇时使用的手性侧链是2R,3S-苯基异丝氨酸衍生物。预先合成这种手性化合物，然后再与二萜母环连接来制备紫杉醇，这是半合成紫杉醇研究中探索最多的一种方法。最早报道的紫杉醇半合成路线采用的就是这种方法[4]。当时以10-DAB为原料，先选择性保护C-7羟基和酯化C-10羟基，然后在二－2－吡啶碳酸酯（DPC）和DMAP存在下，使预先合成的手性侧链与被保护的10-DAB连接起来，最后去掉保护基团即得到紫杉醇，总收率约为53%。合成手性紫杉醇侧链的方法有许多种，其中具有代表性的方法有双键不对称氧化法和醛醇反应法两种。双键不对称氧化法可以从顺式肉桂醇出发，用Sharpless环氧化方法合成出手性的环氧化合物，经叠氮开环等反应最后制得紫杉醇侧链[5]（图5，a）。也可以从反式肉桂酸甲酯出发，在手性催化剂作用下进行双羟基化反应，再将得到的双羟基化合物转化成叠氮化合物，最后也得到紫杉醇侧链[6]（图5，b）。另外，也可以以顺式肉桂酸乙酯为原料，在催化剂Mn-salen络合物、次氯酸钠和4-苯基-吡啶-N-氧化物（PPNO）作用下进行不对称环氧化，合成手性紫杉醇侧链[7]（图6）。醛醇反应法是合成手性紫杉醇侧链的另一种有效的方法。例如，以苯乙酮为原料，在手性催化剂作用下使苯乙酮与烯醇硅醚发生醛醇缩合反应，然后将产物的C-3反式羟基转变为顺式胺基，经处理就得到紫杉醇侧链（图7）[8]。图7醛醇反应法合成手性紫杉醇侧链的路线3.侧链前体物侧链前体物通常是一些环状结构，在与紫杉醇母环的连接过程中前体物开环，产生所需要的立体构型。环状侧链前体物在紫杉醇的合成中具有明显的优势，常用的环状侧链前体有b－内酰胺型、噁唑烷羧酸型、噁唑啉羧酸型和噁嗪酮型等。b－内酰胺型侧链前体物是半合成紫杉醇时常用的一种原料。N-苯甲酰-b-内酰胺的结构如图8所示，整个环状分子呈平面型，所有的取代基都处于环的同侧，当与保护的巴卡亭Ⅲ衍生物进行反应生成紫杉醇时，环较为“空旷”的一面接近巴卡亭Ⅲ衍生物的C-13羟基。羟基进攻张力很大的羰基，导致四元环状侧链前体开环，产生紫杉醇的侧链，同时释放四元环的张力，形成稳定的化合物。b-内酰胺型侧链前体有外消旋型和单一异构体之分。合成外消旋b-内酰胺有多条路线，总收率可达75%以上[9]。一种路线是乙酰氧基乙酰氯与亚胺在三乙胺存在下发生Staudinger反应，得到顺式-β-内酰胺，然后经氧化、去除酰基等步骤得到相应的醇，可用多种保护基保护羟基生成所需的侧链；另一种路线是，带有保护基的甘醇酸酯与三乙基硅基醛亚胺反应生成带保护基的产物；第三种则是吖叮啶-2,3-二酮的还原，产生单一的顺式-β-内酰胺（图9）。噁唑烷羧酸和噁唑啉羧酸是半合成紫杉醇时另一类常用的环状侧链前体物。将苯异丝氨酸侧链的2′-羟基和保护后的3′-NH2用丙叉或其它基团连接起来就得到噁唑烷羧酸（图10，a），还可以制成噁唑啉羧酸（图10，b）和噁嗪酮型（10，c）型环状侧链前体。噁嗪酮与b-内酰胺类似，也可以在DMAP催化下与7-三乙基硅巴卡亭Ⅲ反应或是经过醇盐途径生成2′,7-保护的紫杉醇衍生物，但转化率不如使用b-内酰胺高[10]，可能是反应过程中噁嗪酮分解造成的。7.4.4紫杉醇半合成工艺过程与质量控制从不同的侧链原料出发，可以有多条半合成紫杉醇的路线。其中，以β-内酰胺型侧链前体为原料的路线是一条优良的、具有实际生产意义的路线，可以实现规模化生产[11,12]。整个工艺过程的核心是合成外消旋的β-内酰胺型侧链前体，使之与适当保护的巴卡亭III或10-DAB衍生物进行酯化反应，水解除去保护基就得到紫杉醇。精确控制半合成中各步反应的反应时间、温度、溶剂、催化剂及投料配比等条件，可以使由巴卡亭III出发合成紫杉醇的收率达到90%，由10-DAB出发可达70%以上，生产出的紫杉醇纯度大于99%，满足药用要求。1.工艺流程半合成紫杉醇的过程可依反应顺序大致划分为三个阶段：合成紫杉醇的侧链（或前体物）、选择性保护母环巴卡亭III或10-DAB、使侧链与母环发生酯化反应并去除保护基，最后可得到紫杉醇。图11给出了半合成紫杉醇的工艺流程。生产过程从β-内酰胺型侧链前体的合成开始。首先，制备出的乙酰氧基乙酰氯和亚胺发生[2+2]型环加成反应，合成出基础四元环1-对甲氧基苯基-3-乙酰氧基-4-苯基-2-吖叮啶酮；对其中的部分基团进行氧化、水解和上保护基，得到对接四元环1-苯甲酰基-3-(乙氧乙基)-4-苯基-2-吖叮酮或1-苯甲酰基-3-(三乙基硅基)-4-苯基-2-吖叮酮。制备侧链同时可对母环原料巴卡亭III或10-DAB进行选择性保护处理。接下来，在碱n-丁基锂的催化下，使侧链前体物（对接四元环）与保护后的母环进行酯化反应，得到带保护基的紫杉醇，最后在适当的条件下除去保护基，经过分离、纯化得到成品紫杉醇。在图11给出的工艺流程中，合成出3-(三乙基硅基)-4苯基-2-吖叮啶酮（硅化四元环）后，用叔丁氧碳酸酯(t-BuOCO)2O代替苯甲酰氯进行反应，可得到N-叔丁氧羰基-3-(三乙基硅基)-4-苯基-2-吖叮啶酮，然后与7、10-双保护的10-DAB进行酯化反应，去除保护基，经相应的分离纯化步骤可制备紫杉醇的类似物多烯紫杉醇。2.生产工艺与质量控制β-内酰胺型侧链前体的合成：以β-内酰胺作为紫杉醇侧链的前体，主要是由于β-内酰胺的形成，可以很好地控制反应的立体选择性，不需要使用任何手性试剂就可以产生两个手性中心，这使得该方法成为工业化半合成紫杉醇的最具前景的侧链合成方法之一。从合成乙酰氧基乙酰氯开始，本部分共包括