蛋白质提取纯化鉴定的方法(二)

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二）一、层析技术1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Westernblot对每一种形式的PKM2做相对定量。4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanolgroup)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相柱上的时间越长。反相层析则在固相表面引入不同长度的烷基(C4，C8，C12，C18)，使固相表面呈疏水性，烷基与被分离的化合物表面的疏水基团相互作用。不同的蛋白质分子表面的疏水基团量和空间分布不同，因此不同蛋白质的疏水性不同，疏水性越强，在反相柱上的滞留时间越长，疏水性越弱，在反相柱上的滞留时间越短。用反相层析技术可将疏水性不同的蛋白质分开。反相层析的分辨率非常高，若不考虑蛋白质的活性，反相层析是非常有效的分离和纯化的手段。反相层析技术也可用于鉴定蛋白质纯度。反相层析技术串联质谱是当今鉴定蛋白质分子的重要手段。要注意的是，该技术对样品的制备要求非常高，样品必须是纯净无颗粒物，样品制各的质量直接影响分离，若样品制备差，会直接损毁柱子；要考虑反相柱的孔径(poresize)，选择适合分离蛋白质的反相柱。二、电泳分离技术1.SDS-PAGE常用于鉴定蛋白质的纯度和分子量，也可用于蛋白质的纯化。SDS-PAGE凝胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶的作用是将样品中的蛋白质压成个薄层，分离胶将各种分子量不同的蛋白质分开。SDS带负电，当SDS与蛋白质混合后，SDS与蛋白质分子结合形成复合物，复合物中SDS所带的负电荷大大超过了蛋白质分子所带的电荷，因此在电泳时，蛋白质电泳速率与蛋白质分子量的对数成反比，而蛋白质所带电荷对电泳速率的影响可忽略不计。SDS-PAGE的分辨率非常高。该技术要注意4点：①配胶时，所有溶液都要脱气。丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的交联需要自由基的催化，自由基由过硫酸铵和TEMED(四甲基乙二胺)产生。空气中的氧气可有效清除由过硫酸铵和TEMED产生的自由基，因此抑制丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺的多聚化(polymerization)。不脱气也将导致凝胶质量的批次间差异。②SDS的质量非常重要，SDS中的不纯物(C10，C14，C16alkylsulfate)可导致一个蛋白质形成多个条带。③SDS不要过量，如30～50μl样品中SDS量不要多于200μg，不然蛋白质的条带会变宽，影响分辨率。④过硫酸铵不稳定，需在使用前配制。2.等电聚焦蛋白质是两性电解质，当某个蛋白质在某一pH值时，其所带正电荷和负电荷数相等，净电荷为零，这一pH值就是该蛋白质的等电点。各种蛋白质的碱性和酸性氨基酸残基的量存在差异，这种差异导致蛋白质的等电点不同。根据这一特性可将等电点不同的蛋白质用等电聚焦方法分离。IEF也可用于分离修饰与否的蛋白质，如蛋白质可被磷酸化(加入电荷)、乙酰化(中和电荷)，IEF可将修饰与否的蛋白质分离开(反相层析法也可以)。IEF对样品的制备要求是，要预防同种或不同种蛋白质形成蛋白复合物，尽可能去除样品中的非蛋白质离子。在分离和鉴定复杂的蛋白质成分时(如细胞裂解液)，常常用双向电泳，第一向是IEF，将不同等电点的蛋白质分离，与之垂直的第二向是SDS-PAGE，按分子量将蛋白质分离。双向电泳可以将细胞中的蛋白质分离成数千个组分，对分离到的蛋白质组分做质谱分析，可快速鉴定蛋白质的身份。注意，分离到的组分不。定代表单个蛋白质。