血液学血细胞化学染色.

第三章细胞化学染色技术学习目标1.掌握：细胞化学染色的基本步骤；铁染色、过氧化物酶染色、酯酶染色、过碘酸-希夫染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色的正常血细胞染色反应和临床意义。2.熟悉：细胞化学染色的概念和临床应用。3.了解：细胞化学染色的原理和影响因素。第一节概述一、概念细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学成分(酶类/脂类/糖类/铁/蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。要求：血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。二、必要性从形态学观察，存在较多的主观性；有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。三、临床应用1.辅助判断急性白血病的细胞类型2.辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断3.观察疾病的疗效和预后4.疾病发病机制的探讨白血病的诊断：MICM分型M：morphologyI：immunologyC：cytogeniticsM：molecularbiology形态学分型：进行初步的诊断免疫学分型：明确细胞种类细胞遗传学分型：与疾病预后有关分子生物学分型：提高到分子水平四、基本步骤1.固定（1）物理法：干燥、火焰（2）化学法：A、蒸气固定：甲醛B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇、丙酮。2.显示：有色沉淀反应（1）偶氮偶联法：酯酶染色（2）联苯胺法：POX（3）普鲁士蓝反应：Fe（4）希夫反应：PAS（5）金属沉淀法：NAP（6）物理显色法：SBB3.复染：使各种细胞能显示出来铁染色----中性红、伊红PAS-------甲基绿核：中性红、甲基绿、沙黄等。浆：伊红、刚果红、光绿等。五、研究对象外周血和骨髓新鲜涂片单个细胞中的化学物质：酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等第二节常用细胞化学染色技术铁染色过氧化物酶染色苏丹黑B染色酯酶染色过碘酸-希夫反应中性粒细胞碱性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色一、铁染色（ferricstain）亚铁氰化钾亚铁氰化铁(蓝色沉淀在含Fe部位)铁＋酸性环境普鲁士蓝反应骨髓小粒中的含Fe血黄素（细胞外铁）骨髓中贮存铁幼红细胞内的Fe（细胞内铁）原理二、结果判断1.细胞外铁(骨髓小粒－含铁血黄素)铁颗粒、铁小珠、铁团块细胞外铁(低倍镜观察)（－）：无颗粒（＋）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠（＋＋）：有较多的铁颗粒或铁小珠（＋＋＋）：有很多的铁颗粒、铁小珠和少数铁小块（＋＋＋＋）：有极多铁颗粒、小珠和很多铁小块，密集成堆。2.细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察)（1）分级(按铁颗粒数量的多少及大小)细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。粗大颗粒：很容易看清的颗粒。（2）阳性率观察100个中晚幼红细胞，计算出铁粒幼红细胞的百分比。【结果判断】幼红细胞核染色为鲜红色,铁粒呈蓝绿色。细胞内铁(油镜观察幼红细胞)Ⅰ型：1～2个小铁颗粒；Ⅱ型：3～5个小铁颗粒；Ⅲ型：6～10个小铁颗粒或1～4个大颗粒；Ⅳ型：10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。环形铁粒幼红细胞(ringedsideroblast)幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕核周2/3以上者。铁粒幼红细胞(sideroblast)：胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。铁粒红细胞(siderocyte)：胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞1.细胞外铁：（+）~（++）2.细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约12~44%，I~II型（I型为主），无Ⅲ型、Ⅳ型、环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。三、参考范围四、临床意义铁染色是评估铁缺乏最实用的方法，是反映储存铁的金标准，是临床应用最广泛的细胞化学染色之一。1.缺铁性贫血：外铁（－），内铁10%；治疗有效后，内外铁。2.铁粒幼细胞性贫血：外铁；内铁阳性率，环形铁粒幼红细胞增多，可见粗颗粒的Ⅲ、Ⅳ型铁粒幼红细胞。3.MDS-RAS：内外铁增多，环形铁粒幼红细胞15%。4.非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、白血病等，内外铁正常或增多。5.感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等：外铁增多。五、应用评价铁染色是临床常用的一种细胞化学染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反映机体储存铁的金标准。外铁：反映骨髓中铁的储存量；内铁：反映骨髓中可利用的铁量。二、过氧化物酶染色（peroxidase,POX）一、原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于胞质内酶所在的活性部位。二甲基联苯胺法（DAB）原理POX新生态氧[O]↑过氧化氢（基质中）四甲基联苯胺（无色）联苯胺蓝（蓝色）亚硝基铁氰化钠蓝色颗粒（浆内酶部位）粒、单核细胞胞浆【原理】二、ICSH推荐的三种方法二氨基联苯胺法（DBA）二盐酸联苯胺法过氧化物酶氨基-甲基卡巴唑染色法三、结果判断在细胞质内出现金黄色颗粒为阳性反应。（二氨基联苯胺法）二氨基联苯胺法二盐酸联苯胺法二盐酸联苯胺法【结果判断】-、±、+、++、+++、++++弱阳性颗粒小，分布稀疏阳性颗粒稍粗，分布较密集强阳性颗粒粗大，密布于整个胞浆POX结果判断细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。（－）无颗粒沉着；（a）（±）颗粒细小，分布稀疏；（b）（+）颗粒较粗，局灶分布；（c）（++）颗粒粗大，分布较密，占胞质1/2~2/3；（d）（+++）颗粒粗大，呈团块分布；（e）（++++）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（f）。【正常血细胞染色反应】1.粒细胞系统POX主要存在于粒系细胞中。分化差的原粒细胞阴性;分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成熟逐渐增强。中性分叶核粒细胞：强阳性嗜酸粒细胞：阳性最强嗜碱粒细胞：（－）2.单核细胞系统阴性或弱阳性3.淋巴细胞系统红细胞系统巨核细胞系统阴性浆细胞组织细胞四、临床意义鉴别急性白血病的类型首选（1）急淋和急性髓细胞系的鉴别：急淋：（－），阳性率3%；急单：弱阳性；急粒：阳性（+～+++）。2.单核细胞系统：（－）或弱（+），阳性颗粒少而细小。3.其它系统细胞：淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核细胞系统、浆细胞、组织细胞（－）。【临床评价】急性髓细胞白血病急性淋巴细胞白血病鉴别1.急性髓细胞白血病（1）急性粒细胞白血病阳性反应（2）急性单核细胞白血病弱阳性反应2.急性淋巴细胞白血病阴性反应或阳性率3%(残留原粒细胞)ALLALL原粒阴性原粒弱阳性原粒阳性早幼粒强阳性一、原理苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料，可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。三、苏丹黑B染色（SudanblackB，SBB）正常血细胞的染色反应与POX染色基本一致临床意义与POX染色相似二、SBB与POX区别：1.POX特异性高于SBB，而敏感性低于SBB；2.POX染色要求涂片新鲜，保持酶活性，SBB染色可用陈旧涂片。1.特异性酯酶（specificesterase）主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶”－氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。一、分类四、酯酶染色2.非特异性酯酶(nonspecificesterase)单核、组织细胞中含量较多，粒细胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑制单核细胞中的非特异性酯酶，而不抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。醋酸AS-D奈酚酯酶：NAS-DAEα-醋酸奈酚酯酶：α-NAEα-丁酸奈酚酯酶：α-NBE酸性α-醋酸奈酚酯酶：ANAE(α-NBE敏感性不如NAS-DAE但特异性较之强)（一）特异性脂酶染色1.氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NaphtholAS-Dchloroacetateesterase1.原理氯乙酸AS-D萘酚AS-D萘酚不溶性的有色(红)沉淀。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”NAS-DCE重氮盐(坚牢蓝紫酱)氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色2.正常血细胞的染色反应①粒系(酶活性不随细胞成熟而增强)原粒（－）或（+）早幼粒~成熟中性粒细胞（+）嗜酸性粒细胞（－）或弱（+）嗜碱性粒细胞（+）②单核细胞系统：（－）③肥大细胞：（+）④淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、巨核细胞、血小板：（－）3.临床意义主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：①急性粒细胞白血病：（+）②急性早幼粒细胞白血病：强（+）③急性单核细胞白血病：（－）④急粒-单：粒细胞（+）单核细胞（－）⑤急性巨核细胞性白血病：（－）⑥急性淋巴细胞白血病：（－）原理：非特异性脂酶在相应的pH环境中，将基质液中相应底物水解，产生含萘酚的物质，后者与重氮盐发生偶联反应，形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。（二）非特异性脂酶染色根据pH值的不同分为：酸性：酸性α-醋酸萘酚酯酶染色(ANAE)中性：α-醋酸萘酚酯酶染色(α-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE)碱性：α-丁酸萘酚酯酶染色(α-NBE)名称pH底物生成物重氮盐(产物颜色)α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)中α-醋酸萘酚α-萘酚坚牢蓝B棕黑,灰黑醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNAE)中醋酸AS-D萘酚AS-D萘酚坚牢蓝BB蓝α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)碱α-丁酸萘酚α-萘酚坚牢紫酱GBC红酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)酸α-醋酸萘酚α-萘酚六偶氮付品红红1.α-醋酸萘酚酯酶染色（α-naphtholacetateesterase，α-NAE）α-醋酸萘酚酯酶（细胞内）α-醋酸萘酚（基质液中）α-萘酚重氮盐（坚牢蓝B）胞浆不溶性灰黑色或棕黑色沉淀水解【原理】【结果判断】胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性。α-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色)α-醋酸萘酚酯酶染色a:单核b:BPCc:巨核d:LC(+)e:幼红(-)氟化钠抑制试验在基质液中加入适量NaF,其余染色方法同上。两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率或阳性积分。氟化钠抑制率=抑制前阳性率或阳性积分-抑制后阳性率或阳性积分抑制前阳性率或阳性积分×100%A图：急性单核细胞白血病α-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性B图：急性单核细胞白血病α-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）AB【临床评价】急单急粒急性早幼粒急粒单急淋α-NAE+++或-或++阳性-++++弱+NaF被抑制不被不被抑制部分被抑制抑制部分未被抑制主要用于鉴别急性白血病类型2.临床意义辅助鉴别急性白血病细胞类型急单：单核细胞阳性，能被NaF抑制。急粒：粒细胞弱阳性，不被NaF抑制。M3：强阳性，不能被NaF抑制。M4：部分阳性细胞能被NaF抑制，部分阳性细胞不能被NaF抑制。ALL：原幼淋阴性或阳性，不能被NaF抑制。【正常血细胞染色反应】1.单核细胞系统原始单核细胞分化差阴性分化好阳性幼稚及成熟单核细胞阳性被氟化钠抑制2.粒细胞系统原粒细胞阴性或弱阳性以下阶段为弱阳性3.淋巴细胞系统多数阴性，少数弱阳性不被氟化钠抑制2.α-丁酸奈酚酯酶染色α-NBE原理：血细胞中α-NBE在碱性条件下，基质液中的α-丁酸奈酚水解，产生α-奈酚，后者与坚牢酱紫GBC偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。α-NBE染色反应1.粒系：各期（-）2.单核系：分化差的原单（-）；分化好的原单（+）幼单~成熟单核（+），可被NaF抑制3.淋巴系：TC、非T非B（+）BC（+）4.其他细胞：巨核、有核红细胞、浆细胞（-）或弱（+）组织细胞(+),不被NaF抑制3.酸性α-醋酸奈酚酯酶染色ANAE原理：血细胞中的酸性α-醋酸奈酚酯酶（ANAE）在pH弱酸性（pH5.8）的条件下，可水解基质液中的α-醋酸奈酚，产生α-奈酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于