诱导性多能干细胞的制备优势及临床应用前景

诱导性多能干细胞的制备、生物学特性、优势及临床应用前景河北医科大学基础医学院2015级临床医学三大班16小班李泽夫学号15011010445摘要：2012年10月8日，JohnB.Gurdon与ShinyaYamanaka因制备出诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）及相关领域的研究被授予诺贝尔生理学或医学奖。两位科学家在相差40多年的时间内，探索着一个共同科学问题。1962年，戈登教授发现细胞的特化是可以逆转的。在一项经典实验中，他将美洲爪蟾的皮肤细胞核注入去核的卵细胞中，结果发现部分卵细胞依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。戈登爵士做出这一重大发现之时，正是山中伸弥出生之年。2007年，山中博士所在的研究团队通过小鼠实验，发现诱导表皮细胞使之具有胚胎干细胞特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力。诺贝尔奖委员会认为，他们精彩的成果完全颠覆了人们对发育的传统观念，关于细胞命运调控和发育的教科书内容已被重新改写。关键词：诱导性多能干细胞、制备方法、生物学特性、与ES细胞相比的优势、临床应用前景与试行治疗方案引言：诱导性多能干细胞（iPSCs）具有类似于胚胎干细胞(ESC)的全能性，又无道德伦理争议，而且来源广泛，避免了免疫排斥反应，为整个干细胞生物学领域和临床再生医学提供了新的研究方向，因而被评为2008年年度十大进展之首。山中博士亦因在细胞重编程领域的杰出贡献，获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。诱导性多潜能干细胞在疾病的模型建立与机制研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值，因此在用于临床治疗前，国内外学者针对其安全性问题进行了广泛深入的研究，采取了多种措施提高诱导性多潜能干细胞的安全性。本文重点对诱导性多能干细胞的制备方法、生物学特性、与ES细胞相比具有的优势、临床应用前景和面临的问题及从理论上设计应用诱导性多能干细胞临床治疗帕金森病方案进行论述。1.诱导性多能干细胞的研究历程2006年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志《Cell》上率先报道了iPS的研究。他们选择已证实的与“分化能力”相关的24种基因作为候选基因，寻找能够诱导细胞转化为其他类型的关键因子，通过研究，他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种基因通过反转录病毒载体导入小鼠胚胎或皮肤成纤维细胞，发现可诱导可诱导其发生转化，产生iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞极为相似。2007年11月，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。所不同的是，日本实验室依然采用了反转病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子组合而Thompson实验室采用了以慢病毒载体引入Oct3/4、Sox2加Nanog和LIN28这种因子组合。这些研究成果被美国《Science》杂志列为2007年十大科技突破中的第二位。2008年哈佛大学GeorgeDaley实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者的皮肤成纤维细胞转变成iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。美国科学家还发现，iPS可在适当条件下定向分化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分泌胰岛素，有效降低血糖。这表明利用诱导重编程技术可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能干细胞这一步。2009年，中国科学家于2008年11月利用iPS细胞培育出小鼠“小小”。中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大学医学院曾一凡研究员领导的研究组合作完成的工作表明，利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示，这一研究成果表明iPS细胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。iPS细胞是由一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中产生。在生成过程中，2006年日本京都大学山中伸弥等，首次报道通过转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，在体外直接将小鼠体细胞诱导成胚胎干细胞（ESC）样细胞，并将命名为诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）。随后，美国研究人员使用了四种遗传基因，同时加入了七种包括可阻滞特定蛋白合成的物质和酶在内的化合物，以研究其各自的制造效率。研究结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入率为0.01%至0.05%，而加入了叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻滞剂之后，导入率竟升至9.6%至14%。如果从这四种遗传基因中排除导致细胞癌变的遗传基因，只使用三种基因，过去的导入率只有0.001%，甚至更低；而加入“巴尔普罗酸”之后，其效率提高了约50倍。研究人员认为，这很可能是因为“巴尔普罗酸”可以促进多能遗传基因的活性。今后，研究人员将就添加化合物是否会使遗传基因产生变异展开研究，以在提高制造效率的同时保证安全性。2.诱导性多能干细胞的制备方法到目前为止，iPS技术已相继在小鼠（Takahashik等，2006）、人（TakahashiK等，2007；YuJ等，2007）、猕猴（LiP等，2008）和猪（EstebanMA等，2009）上取得了成功。目前基因导入技术是制备iPS细胞的主要技术，基因载体的改良推动无遗传修饰iPS细胞的建立。载体主要有整合型载体、非整合型载体及新型载体。早期使用的病毒载体，如反转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单一慢病毒载体及piggyBac转座因子都属于整合型载体。要想了解诱导性多能干细胞的制备方法，首先需要对干细胞、诱导性多能干细胞的概念有一定的认识。因此这里先介绍干细胞、诱导性多能干细胞及相关其他物质的概念，在主要介绍反转录病毒载体介导的iPS细胞的诱导。2.1干细胞的定义及其基本特性干细胞（stemcells）是指一类具自我更新和多向分化潜能的细胞，它们具有自我复制能力，并且在一定条件下能分化成各种具有特定功能的体细胞(somaticcells)。自我更新是指细胞分裂之后能够维持其原有特性的能力。具有自我更新能力的细胞经过细胞分裂之后，所产生的子细胞中至少应有一个与母细胞是完全一样的。多向分化潜能是指能够分化形成不同类型组织细胞的能力。同时，这一概念狭义上讲，也包括单能干细胞（unipotentstemcells），只具有分化成机体特定的细胞和组织的能力。2.2诱导性多能干细胞的定义诱导性多能干细胞是指由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。具体定义是向皮肤组织等细胞中导入特定基因或是特定基因产物（蛋白质），使该体细胞变成具备如同胚胎干细胞般，具有分化成各种细胞之分化能力，并且可以持续增生分裂的细胞。2.3参与维持干细胞特性的主要内在调控因子Oct4（也称为Oct3/4）由Pou5fl基因所编码，是一个POU蛋白结构域转录因子。Oct4特异性表达在小鼠早期胚胎具有全能性的所有细胞、未分化的小鼠ESCs、畸胎瘤细胞和胚胎生殖细胞中，而在胚胎成纤维细胞和ESCs分化得到的细胞中几乎不表达。Oct4是维持干细胞的关键分子之一，它的表达水平决定了干细胞的命运。Oct4基因敲除的小鼠胚胎只能发育到类似囊胚阶段，但是囊胚内的细胞全部为滋养外胚层细胞，因此它被认为具有抑制内细胞团细胞分化为滋养外胚层和其他细胞器的功能。Oct4在ESCs中的功能主要是通过与其相互作用的蛋白及其调节的下游靶基因基因而实现。Nanog是一个NK-2家族的同源盒（homeobox）转录因子，它的内细胞团具有全能性的细胞中广泛表达，也可以在未分化的ESCs、原始生殖细胞和EGCs中被检测到。Nanog的功能是维持胚胎的原始外胚层细胞，而抑制原始内皮层的形成。它通过转录抑制促进分化发生的基因来调节ESCs的分化。对于Nanog在胚胎发育过程中和ESCs分化过程中的详细调控机制，还需要更多的实验数据来阐明。2.4细胞重编程的机制细胞重编程是指由体细胞向全能细胞的转变。细胞的重编程是一个极其复杂的过程，其机制的研究对诱导性多能干细胞细胞的制备、制备效率的提高、安全性的评估、临床应用都有着非常重要的作用。目前关于重编程的机制普遍认为，体细胞通过导入外源性的转录因子可以激活内源性的Oct4与Sox2的表达，一旦内源性的Oct4与Sox2得以表达后，便会迅速在细胞内形成一个自我调节的网络用以维持诱导性多能干细胞的多能性，此后即不再需要外源性基因的诱导与维持[20]。对于在重编程中每种转录因子的具体作用、不同转录因子的组合是否通过相似的机制等问题人们还知之甚少，还有待于进一步的研究。2.5诱导性全能干细胞的制备方法iPS细胞系的建立主要包括以下几个步骤：①重组因子的选择。②目的细胞的选择。③重组因子的导入。④重组因子在目的细胞内的表达。⑤iPS细胞的产生。⑥重组细胞的鉴定。以下本文将重点介绍人的iPS细胞的诱导步骤。主要实验仪器设备：移液器（10μl、200μl、1000μl）、常温离心机、高速冷冻离心机、电泳仪及电泳槽、梯度PCR仪、超净工作台、紫外凝胶成像系统、架盘天平、生化培养箱、注水式恒温培养箱、恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、电热恒温水槽、旋涡混合器、超低温冰箱、荧光倒置显微镜主要实验试剂配制：DMEM基础培养液：将DMEM粉溶于超纯水中，加入3.7g碳酸氢钠，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤后分装于培养瓶中，4℃备用。PBS缓冲液（pH7.4）：称取PBS粉剂9.55g，溶于1L超纯水中，高压灭菌，通过0.22μm滤膜后分装于灭过菌的培养瓶中，4℃备用。0.1mmol\Lβ-巯基乙醇：β-巯基乙醇原液70μl溶于10ml灭菌超纯水，0.22μm滤膜过滤后无菌分装，-20℃冰箱保存。0.1%明胶溶液：将0.2g明胶粉剂溶于200mlPBS溶液中，高压灭菌，0.22μm滤膜过滤后无菌分装，-20℃冰箱保存。0.25ml胰酶：将0.25g胰酶和0.04gEDTA溶于100mlPBS溶液中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤后无菌分装，-20℃冰箱保存。1mg\mlⅣ型胶原酶：将100mgⅣ胶原酶粉溶于100ml基础培养基中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤后无菌分装，-20℃冰箱保存。成体细胞培养液：DMEM基础液中加入10%FBS，，0.22μm滤膜过滤后分装于培养瓶中，4℃保存。iPS细胞培养液：KO-DMEM中加入10%ES血清（V∶V）,10%胎牛血清（V∶V），2mol\L谷氨酰胺，0.1μmol/L非必需氨基酸，0.1μmol/Lβ-巯基乙醇，10ng/mlbFGF，10ng/mlLIF，50mg/青霉素和链霉素。⑵先用凝胶预包被一个T25瓶，包被时间约为10分钟。⑵接种皮肤成纤维细胞并培养，待细胞生长良好时，用0.25%胰蛋白酶消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，之后取出用于感染实验所需的细胞量，比如1×10^5个。⑶若感染1×10^5个细胞，以感染比例10∶1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，以免对后续实验产生影响。⑷然后将1×10^5个细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后足至5ml，最后加入5μl助转剂凝聚胺，使用浓度为10μg/ml，将整个体系混匀后转移到已经包被好的T25瓶中，摇匀后放入37℃培养箱中过夜。⑸病毒感染24h后，第一天将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。按T75瓶每瓶铺5×10^4个细胞铺2个T7