第4章基因工程的主要技术及其原理

第四章基因工程的主要技术及其原理第一节DNA和RNA的提取与纯化一DNA提取的基本原理与方法（一）DNA提取的基本原理DNA的性质：1)DNA是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达10g/L，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。2)DNA与核蛋白复合体DNP在在低盐浓度（0.1mol/LNaCl）溶液中溶解度最低（为水中的1%），在高盐浓度（1mol/LNaCl）溶液中溶解度较高（为水中的2倍），而核糖核蛋白RNP受盐浓度影响较小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将DNP和RNP分开。提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/LNaCl）将DNP抽提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。(1).细胞裂解和DNA的溶解；一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对DNA的破坏：1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。DNA提取的步骤：EDTA：螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性；SDS：变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性；抗氧化剂：PVP，β-巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，DTT降低酚类氧化对DNA的干扰PVP：有效去除酚类和多糖物质。(2).与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；CTAB:十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与蛋白质分开。SDS:十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核蛋白解聚，使DNA游离出来，再根据DNA和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚-氯仿抽提蛋白。苯酚-氯仿:对蛋白质具有极强的变性作用，而对DNA无影响。RNA杂质:用不含DNA酶的RNA酶去除。(3).DNA的沉淀与纯化溶解在上清液中的DNA加入2倍体积的无水乙醇使其沉淀。在多糖、蛋白含量高时用1倍的异丙醇沉淀效果较好。（二）DNA提取的几种方法根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以下几种方法：1.浓盐法原理：根据RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。方法1：用1mol/LNaCl抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，离心，DNA位于上层水相，回收水相，用2倍体积的95%乙醇或无水乙醇将DNA沉淀出来。方法2：用0.15mol/LNaCl反复洗涤细胞裂解液除去RNP，再用1mol/LNaCl抽提DNP，然后用氯仿-异戊醇除去蛋白。以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使DNA解离；使用SSC溶液（5mol/LNaCl、0.015mol/L柠檬酸钠）抑制DNase降解DNA2.SDS法原理：SDS使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。3.CTAB法原理：在细胞裂解液中，加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来。再经氯仿-异戊醇抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，经乙醇或异丙醇沉淀即得到DNA。4.苯酚抽提法原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相，用乙醇沉淀，即得到DNA。5.水抽提法原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去RNA，将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，离心后收集上清液，加入固体NaCl调至2.6mol/L，加入2倍体积的95%乙醇，然后，分别用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗DNA，经干燥后即得DNA样品。在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。碱裂解法提质粒DNA的原理：（三）质粒的提取二RNA提取的基本原理与方法（一）总RNA提取的基本原理与方法1.总RNA提取的原理真核生物RNA分子主要存在于细胞核与细胞质中。总RNA：rRNA，tRNA，mRNA。其中mRNA仅占总RNA的1％-5%，分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。能否成功提取RNA，关键在于能否完全抑制或除去RNA酶的破坏作用，获取完整的全长RNA分子。RNA酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存在十分广泛并十分稳定，非常耐热，在较宽的pH范围内有活性，及其顽固。1）所有玻璃器皿应置于180℃烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121℃高压消毒40分钟；2)全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套；3)RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2水溶液中，室温10分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。提取RNA的实验必须采取以下措施：1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底；2)使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等；3)有效地抑制内源及外源RNase活性；4)将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低pH的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。提取RNA的方法一般包括4个关键点：2.总RNA提取的方法(1)酚-异硫氰酸胍提取法。Trizol试剂是最广泛的抽提总RNA的试剂，即根据酚-异硫氰酸胍提取法设计。提取步骤：在液氮中研磨样品，使细胞破碎→加入Trizol试剂，溶解细胞成分→加入氯仿抽提蛋白，离心分离水相和有机相→收集含RNA的水相→异丙醇沉淀可获得RNA样品。(2)离心分离法。过柱纯化，将含RNA的细胞破碎液加在含硅胶膜的柱子上，通过柱子时，RNA被硅胶膜吸附，与其他杂质分开，然后在低盐溶液或水中将RNA洗脱下列。（二）mRNA的提取真核生物mRNA的提取途径有两条：其一：抽提细胞总RNA，经蛋白酶K除蛋白，在利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤维素柱层析，把mRNA与tRNA、rRNA分开。真核生物mRNA的3’末端带有一串长约200个腺苷酸的polyA序列，其他RNA没有这样的结构，从而可用polyT将mRNA结合将其分离。基因表达具有时空特异性，分离与目的基因时空表达相对应的mRNA是实验成功的关键。其二：先提多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开，利用抗原抗体反应，将微量特异的mRNA提取出来。二DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。（一）紫外分光光度计法测定DNA、RNA的浓度和纯度DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外区具有较强吸收，吸收峰在260nm处。1个OD260相当于50ug/mL的双链DNA；1个OD260相当于40ug/mL的单链RNA；蛋白质的最大吸收峰在280nm处，多糖的最大吸收峰在230nm处。对于DNA，OD260/OD280≈1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质、苯酚等的污染。对于RNA,OD260/OD280=1.8～2.0之间，小于1.7表明有蛋白质和苯酚污染，大于2.0表明有异硫氰酸胍残留。（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定采用琼脂糖凝胶电泳可以粗略鉴定DNA和RNA的含量和纯度。EB(溴化乙锭）：DNA的染色剂。该物质能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下发荧光的特性。利用EB染色的DNA样品的亮度可粗略定量，而通过条带的清晰度判断是否降解如果DNA有降解，则在电泳图谱上表现出明显的拖尾。一般用常规的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。第二节凝胶电泳DNA的等电点偏酸，当处于电泳条件（pH=8）时，DNA链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于DNA链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加而增加。所以，实际上DNA分子的荷质比始终是一常数，电泳中分离DNA靠的是分子的大小与构型的不同。一琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持介质，在适当条件下对带电生物大分子进行分离。琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，是D-半乳糖和脱水3,6-L-半乳糖连接而成的一种线性分子，具有亲水性，不带电，不引起DNA变性，不吸附分离物质的特点。凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。不同类型琼脂糖分离DNA片段大小范围（二）凝胶电泳的影响因素1、DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2、DNA的分子构型。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环DNA分子移动最慢。3、凝胶浓度。一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。4、电场强度。电压一般不超过5v/cm，电压高，电泳快，但分辨率低。电压低，电泳慢，但分辨率高。5、溴化乙锭。荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。6、电泳缓冲液。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。二琼脂糖变性胶电泳RNA为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。不同的RNA分子空间结构不同，在未变性条件下，其相对分子量与电泳一定距离没有严格的相关性。常用的RNA变性胶有两种：其一为含有乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）的凝胶；其二为含甲醛的凝胶。水平电泳√三聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳聚丙烯酰胺凝胶，既具有分子筛效应，又具有静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶，可达一个核苷酸。同时又可用于蛋白质的分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。常用的催化方法有化学聚合和光聚合：化学聚合需加入催化剂过硫酸铵(AP）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED)。光聚合是核黄素在光照射下及有微量氧存在时产生自由基使凝胶聚合。聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。电泳漕分上漕和下漕，各装有电极，通过凝胶使它们连成导电的整体。电泳中带有电荷的分子在电场作用下移动，移动速度依赖于电场强度、分子净电荷以及分子的大小和形状，同时也与介质的离子强度、黏度和温度有关。四脉冲场凝胶电泳常规琼脂糖凝胶电泳中，在一定的分子量范围内DNA片段泳动速率与分子量大小呈线性关系，但当DNA分子大小超过凝胶孔径，DNA分子将由无规则卷曲的构象沿电场方向伸直，变成与电场平行以通过凝胶空隙，这样大分子通过凝胶的速率无差别，因此无法区分。脉冲电场电泳是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使DNA在微观上按“Z”形向前泳动，从而区分不同大小的DNA分子。脉冲场电泳可区分50kb或100kb以上的大片段DNA分子。五凝胶电泳中DNA的检测凝胶中DNA的检测方法主要有三种：1.EB染色，然后在紫外灯下观察，主要用于琼脂糖凝胶；2.银染显色法，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；3.放射性同位素标记发，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。第三节核酸和蛋白质的分子杂交核酸分子杂交原理：双链DNA或具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火或复性过程。形成的分子有DNA/DNA,DNA/RNA杂合分子形式。一探针的标记探针：是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的D