西北农林科技大学生物技术综合大实验

生物技术综合大实验——原核系统表达的绿色荧光蛋白的纯化宋捷（2012014069）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新（西北农林科技大学）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。关键词：GFP蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。2.材料和方法2.1.pGFP质粒克隆及提取质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于1.5ml离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm离心3min，转移上清于另一新1.5ml离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μlTE中溶解，冰上暂存。2.2.转化取1.5mlOD6000.3~0.4BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl0.1MCaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl0.1MCaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μlLB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。2.3.筛选重组子及扩大培养将平板放置紫外灯下检测，标记，挑取绿色荧光单菌落，于5mlLB（amp）培养基中37°C、150rpm震荡培养7小时——吸取2ml菌液，置于200mlLB（amp/ara）培养基中，37°C、150rpm振荡培养过夜。本组的平板并无可视菌落，所以挑去他组菌落2.4.收菌破碎收集菌液200ml于250ml离心管，共4管，5000xg离心10min，弃上清——每管30ml溶解缓冲液（50mMTris-HCl，1mmol/LEDTA）重悬沉淀，将4管合并为1管——每管加入60μl溶菌酶，混匀将离心管置于冰上，超声波破碎仪探头插入离心管，探头离底部约1cm且不触离心管壁——900w，超声3s，静止3s，共8min，重复3次——7500xg离心15min，在紫外灯下观察沉淀（留样）和上清（留样），取上清备用。2.5.盐析取上清定容至80ml——取10ml做预实验——用溶解缓冲液稀释至100ml——分装至10只试管，每管10ml——称取不同浓度梯度(NH4)2SO4（见下表），室温静置15min——各取1ml于1.5ml离心管，7500rpm离心15min——在紫外灯下观察GFP沉淀情况，可看出，第五管（(NH4)2SO4含量50%）时出现沉淀（杂蛋白），第八管（(NH4)2SO4含量80%）沉淀量最大（GFP）——在剩余70ml上清中加入20.37g(NH4)2SO4（含量50%），室温静置30min——7500rpm离心15min，取上清——加入36.12g(NH4)2SO4（含量80%），室温静置15min——7500rpm离心15min，弃上清，-20°C保存。(NH4)2SO4（%）10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%(NH4)2SO4（g）0.701.061.642.262.913.614.365.166.037.062.6.疏水层析配制平衡缓冲液：2mol/ml(NH4)2SO4/TE,PH8.0startbufferA：1.3mol/ml(NH4)2SO4/TE,PH8.0洗脱缓冲液B：10mMTris，1mMEDTA，PH8.0将沉淀好的GFP用10ml平衡缓冲液溶解，9000rpm离心10min，移上清液至另一大离心管备用。连接仪器，蒸馏水洗柱，确保仪器运行正常——填装柱材（PhenylSephadexCL4B），用3倍体积（约120ml）的平衡缓冲液平衡柱子（转速29转/分）——将含GFP的上清液上柱，3倍体积（约120ml）洗脱缓冲液洗脱（转速60转/分）——紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用离子交换层析的startbufferA（20mMTris-HCl，pH7.0）透析过夜。2.7.阴离子柱层析配制startbufferA：20mMTris-HCl，pH7.0洗脱缓冲液B：20mMTris-HCl，pH7.0（含1MNaCl）将疏水作用层析的透析袋用PEG10000浓缩——startbufferA洗柱——填装柱材（DEAESephadexA50），用3倍体积（约120ml）的startbufferA平衡柱子（转速30转/分）——将含GFP的浓缩液上柱，3倍体积（约120ml）startbufferA及洗脱缓冲液B梯度洗脱（转速60转/分）——紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用凝胶过滤层析的缓冲液（20mMTris-HCl，pH7.0）透析过夜。2.8.凝胶过滤层析配制缓冲液：20mMTris-HCl，pH7.0将离子交换层析的透析袋用PEG10000浓缩——缓冲液洗柱——填装柱材（SephadexG-75），用3倍体积（约120ml）的缓冲平衡柱子——将含GFP的浓缩液上柱，缓冲液洗脱——紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用PEG10000浓缩——浓缩好的液体收集备用。2.9.SDS凝胶电泳检测3.实验结果GFP用硫酸盐最佳沉淀点的选择收集硫酸铵浓度在50%~80%的蛋白质沉淀。3.1.3级层析图谱疏水层析图谱收集紫外荧光显色较亮的四管，对照图中区域大约如箭头所示（陡升由于调高了敏感度）离子交换柱层析收集紫外荧光显色较亮的3管，对照图中区域大约如箭头所示凝胶过滤层析图中所显示区域未收集，在所示时间外有一管带微弱荧光，收集。3.2.SDS-page电泳图3.3.自左向右箭头所指条带依次是1他组三级纯化产物2本组三级纯化微弱荧光样品3离子交换纯化产物，4离子交换层析传出+wash，5Maker，6疏水层析产物浓缩产物，7疏水层析产物，8疏水层析wash，9细胞破碎后上清，10细胞破碎液体（可靠性较高的1，2，3，9,10标示泳道，蓝色箭头位置推测为目标条带）4.分析与讨论4.1.本组的重组子平板次日早晨检查时并没有可视菌落出现，继续培养，到下午是可看到2到3个绿色的重组子群落，分析可能是1.转化后菌株过于脆弱2.可能氨苄涂抹过多3.涂布器使用时未控制好温度4.2.在用硫酸盐沉淀的时候，，我总是主张直接用最大浓度硫酸盐直接沉淀，应该是有问题的，GFP有明显的荧光信号，很容易在盐析粗提的时候去除溶解性相差较大的杂蛋白。4.3.细胞破碎后收集的液体有十分明亮的荧光，GFP的疏水性较强，可与柱材上疏水基团结合，在盐离子浓度降低时解离，疏水层析结果如图，推测前几个峰出现时洗掉了数个杂带，可惜SDS电泳时失误，并不能看出哪些条带被洗掉。在装自装柱时，由于我并不熟练，导致柱子上盖胶条不紧，以及忘记初始化自动收集装置（阀门就没开），使得在平衡柱子的时候不停漏液，耽误了进度，也浪费了柱子4.4.离子交换柱有十分好的纯化效果，目的蛋白区域有极高的吸收峰，局部浓度可能过高，下次要减缓流速，因为无法测量当时离子浓度，并不能给蛋白解离离子浓度区域给出建议，从电泳图上看，第三道，目标蛋白十分清晰，在上方存在数个杂蛋白（5个？）4.5.凝胶过滤层析时，出现了数个失误1改变柱子压力位置，2转速过大（压力过大），3柱子填充过多，吸出一部分重装填，导致凝胶分层（后期大量蛋白卡在分界面）4与组员没有商讨好实验方案，导致中途实验进程不顺利，5出现下方爆管，凝胶及蛋白漏出，重装填后不能洗出。电泳图上出现大量抖峰，是管内出现气泡所致，原因可能如下1从下方给予负压，且流速过大2下方的管口漏气（一侧缝隙我们添加了液体，并未漏泄，接口处可能漏液），3凝胶的缝隙中本身有空气，4，buffer并未排气，在负压条件下溶解的空气被析出4压强过低出现真空泡由于出现了大量蛋白卡在分界面上，且前期从电泳图上看到分离出约两种杂蛋白，我们采取了倒出胶体重新装柱，重新洗脱的方法，所以紫外吸收图谱并未记录。4.6.凝胶电泳的分离胶是我配的，一块水封时候用力过大，出现了凹面，并未有多余，所以只好自用，对点样结果的的美观性有影响，组员点样的时候可能出现失误，使得5,6,7,8与位置不符合，可能未点上。从前三个泳道分析，小韦组结果十分好，目标条带及其明亮，可能我们组拿的并不是波峰管，所以上方有微弱杂带。我们的离子交换柱结果较好，凝胶柱图谱上显示两个杂蛋白，在电泳图上的确比离子柱少两个杂带，图上红色所示，层析依旧是有作用的。泳道4，推测是离子交换柱的穿出和wash液，目标条带区域有浅色痕迹，可能是蛋白与柱体结合不紧密，依旧有少量渗漏。5.参考文献陈鹏生物技术综合大实验西北农林科技大学生物技术大实验邓超等绿色荧光蛋白及其应用中国生物工程杂志赵仲麟等内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化河南农业大学学报参考文献