第9章蛋白质工程

•亲和标记是根据酶和底物的亲和性，修饰剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团,而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。•这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。8.6亲和标记•亲和标记设计要满足两个条件：1.亲和试剂必须含有能与某些氨基酸残基起反应的化学基团2.亲和试剂应当对活性部位专一性结合蛋白质的正常配位体、底物和抑制剂的结构都可以作为设计亲和试剂的参考。光亲和试剂•是一类特殊的亲和试剂•它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。•先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结合，然后被光照激活后，产生一个活泼的功能基团，能与它们附近基团反应，形成一个共价的标记物。5酶分子化学修饰的应用活性中心的研究化学修饰法、X-光晶体衍射法、核磁共振。酶的空间结构研究采用具有荧光特性的修饰剂，可借助荧光光谱研究，分析各基团在酶分子中的空间分布情况。采用巯基修饰剂，可了解酶分子中半胱氨酸的数目及分布情况，确定肽链的数目和二硫键的数目。酶的作用机制研究了解各种残基及侧链基团在酶催化过程中的作用。二、在医药方面的应用例：大分子修饰提高超氧物歧化酶的稳定性该酶能保护DNA、蛋白质和细胞膜，使它们免遭超氧负离子的破坏3.应用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG－天门冬酰胺酶（ASNase）•消除了抗原性•延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextran修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。化学修饰方法的局限性扩散速度受限生物活性降低修饰剂呈现多种聚合度，选择性不高提高酶性能的方法：1）从自然界筛选或诱导变异具有不同性质的突变体不能保证在获得一种有利的突变时不会损害另一优良性能。2）蛋白质化学修饰不够专一，对分子内部的一些疏水氨基酸的侧链也无法予以修饰。3）化学合成对于分子量大于1万道尔顿的蛋白质，从经济和技术上不能满足工业用酶或蛋白质的要求。第九章酶的蛋白质工程途径方法优点不足酶分子改造核酸水平蛋白质工程从根本上提高酶分子稳定性操作复杂，周期长蛋白质水平化学修饰适应所有酶，操作简单经济修饰过程破坏酶分子剂型固定化适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产载量较低，易失活交联酶晶体稳定性好，载量高，催化效率高成本高微环境改良稳定剂简单、经济工作量大反应介质适用于特殊反应体系和酶类适合的酶类还不普遍一、蛋白质工程概念：根据蛋白质的结构规律及其功能的关系，对蛋白质进行改造，以生产出性能更加优良的新型酶分子。是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。基因工程与蛋白质工程：基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。基因工程可以使在人类控制的条件下生产任何自然界中已存在的蛋白质以满足人类的需要。蛋白质工程的出现可使人类可以生产自然界根本不存在的,但其性质又是人类所期望的新型蛋白质。因此蛋白质工程又称为第二代基因工程。二、蛋白质的功能基础蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。蛋白质的空间结构依赖于其所含的氨基酸序列,而氨基酸的序列又由其编码基因的核苷酸序列所决定。因此按预定方案通过对编码该蛋白质基因的改造应用基因工程技术就可以获得新型的蛋白质分子。蛋白质结构测定一级结构测定：•直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。•间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。三级结构测定：•X-射线晶体衍射——研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构•核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。X-射线衍射技术：用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。三、蛋白质工程的主要手段蛋白质工程的长远目标是创造人类所需要的各种性能优越的人造蛋白质。但目前主要是通过基因突变手段以制取天然蛋白质的各种人工突变产物。以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。位点特异性突变—基于结构生物学、信息生物学基因突变随机突变——基于高通量筛选法基因内部的剪接基因剪接5‘或3’端的剪接•定点诱变(site-directedmutagenesis)•在体外使DNA分子内部的特异部位发生突变的过程。•最常用的方法是合成一条序列有变异的寡核苷酸，使其与靶DNA分子杂交/退火，再合成完整的DNA。定点突变的方法•产生随机突变的方法：•化学诱变，错掺诱变，盒式诱变。•高通量筛选法：从巨大数目的突变体库中筛选到具有期望功能的突变体。•筛选方法：表型观察筛选，当筛选的蛋白可以产生可见信号时，用简单的表型观察和筛选被广泛应用。目前，蛋白质突变体库筛选一般是固态（琼脂糖和滤膜）或者液态（微量滴定孔板）条件下通过表型选择和筛选而完成的。•高通量筛选蛋白质突变体库的方法：噬菌体展示技术（phagedisplay)。适用范围：抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物的开发研究方面基因内部剪接在编码基因的内部插入或剪去特定的序列、结构原件或结构域。5’或3’端的剪接融合基因可以用于在体外产生不同基因或基因片段之间的融合，产生融合蛋白。①避免目的蛋白在表达时被降解②增加分泌性（信号肽）③提高溶解性（硫氧化还原蛋白）•重组酶的高效表达•一、细菌表达体系•二、酵母系统中的表达•三、丝状真菌中的表达1.用大肠杆菌表达体系生产重组酶常用宿主菌株的基因型DH5：supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1JM109:supE44,hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1∆(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZ∆M15大肠杆菌表达载体必备元件：目前在原核系统中使用得最普遍的强启动子主要有5个：①大肠杆菌的lac启动子：②大肠杆菌的trp操纵子的启动子：③将lac启动子的一10区和trp启动子的一35区融合起来的tac启动子；④T7噬菌体中基因10的启动子；⑤l噬菌体中的左向启动子PL。这些启动子都是通过和阻遏蛋白的相互作用，来控制基因转录的启动和停止的。lac/tac/trc启动子的表达调控Plac+1rbsFGTerminatormRNAIPTG阻遏蛋白二、酵母表达系统例1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是重要的医用酶。大肠杆菌表达体系能将N端的甲硫氨酸除去，但不能将第二个氨基酸(Ala)乙酰化。需用真核系统表达！基因源：人的Cu/Zn-SODcDNA基因质粒载体：酿酒酵母2mm质粒启动子：酵母甘油醛磷酸脱氢酶(GAPD)启动子附加：转录终止信号、poly(A)信号。宿主细胞：Leu缺陷型的酿酒酵母。酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达系统的缺点：1.表达水平偏低2.表达质粒易丢失3.重组蛋白常发生超糖基化4.分泌效率差嗜甲醇的酵母(Pichiapastoris)优点：能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。乙醇氧化酶基因aoxl的启动子是一个很强的诱导型启动子，甲醇诱导时，酶产量可达总蛋白的30％。毕赤酵母载体包括自主复制的游离载体和整合型载体，由于没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。宿主细胞为组氨酸脱氢酶缺陷型(HIS4一)牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表达牛溶菌酶作用于细菌的细胞壁，具有抗蛋白酶的功能。可用作为促进反刍动物消化的饲料添加剂。牛溶菌酶前体经P．pastoris正确修饰后分泌到培养基中，分泌的蛋白与天然溶菌酶活性相当，在10L发酵罐发酵200h，产量达2g/L。丝状真菌牛溶菌酶基因表达质粒三、丝状真菌表达体系得到发展主要理由是∆丝状真菌的发酵技术成熟，有利于重组蛋白生产的工业化；∆丝状真菌具有很强的分泌能力，有望提高重组蛋白的生产效率；∆新表达系统的建立可避开大肠杆菌生产重组蛋白的专利限制；∆米曲霉和黑曲霉等丝状真菌被FDA和世卫组织认定安全。质粒载体元件在丝状真菌中的选择标记：a.营养互补标记：ade(腺嘌呤)、trp等很多。b.优点：载体质粒可进行同源整合，易于筛选；缺点：大多数丝状真菌难获得营养缺陷型。b.显性标记：包括药物抗性标记，如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌灵抗性等c.细菌的报告基因：在丝状真菌启动子带动下的表达，也可作为选择标记，如GUS等。表达水平：与多种因素有关，包括选用的启动子及其他调控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷贝数和受体菌株等。稳定性：转化子在有丝分裂过程中，多数经过几十代的有丝分裂。但经过减数分裂表现出高度的不稳定。第三节蛋白质工程成果及应用一.蛋白质工程的成果在十几年里,蛋白质工程已取得鼓舞人心成果。1.基础研究方面:酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP存在的条件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸转移到tRNA的3'末端形成酪氨酰tRNA。研究表明该酶与其底物之间能形成11对氢键,其中8对氢键的形成来源于酶的氨基酸侧链。1989年,Eersht等人应用蛋白质工程技术对这8个侧链残基进行系统突变以揭示侧链在整个酶促反应中的作用以及对决定酶与底物结合专一性方面的影响。他们还发现酶与过渡态分子的结合力可直接影响酶促反应的速度。枯草杆菌蛋白酶的蛋白质工程洗衣粉中对酶的稳定性有影响因素：•表面活性剂：破坏酶的蛋白质结构•漂白剂：化学氧化抗氧化性结果是Ala222抗氧化性最强应用蛋白质工程已取得的研究成果实例─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────诱变蛋白质氨基酸突变原定目标结果─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────T4溶菌酶Ile→Cys构建二硫键成功增加热稳定性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────枯草杆菌Gly→Lys拓宽酶作用的成功蛋白酶底物范围Ala→Leu提高抗氧化性能────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────α-抗凝酶Met→Val提高抗氧化性能成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────胰蛋白酶Gly→Ala提高酶水解专一性成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-内酰胺酶Ser→Cys验证Ser对该酶成功的重要性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-干扰素Cys→Ser提高稳定性成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────白细胞介素-2Cys→Ser提高产物活性不成功(产物稳定性↓)─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────二氢叶酸Asp→Asn验证酶的活性成功中心还原酶────────────────────────────