细胞凋亡、细胞周期

BD流式系列课堂-1：研究细胞生命活动的流式解决方案细胞凋亡概述•又称为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)是机体主动的、高度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死(Necrosis)相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。薄膜有小泡状形成细胞凋亡与疾病的关系3细胞凋亡事件发生表细胞膜事件线粒体事件Caspase事件细胞核事件1.细胞膜变化的检测：AnnexinV/PI磷脂酰丝氨酸(PS)的检测：早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定早期凋亡特征：•磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性•DNA没有发生断裂早期凋亡PS检测及结果判定AnnexinV-FITCPI细胞膜变化的检测：AnnexinV/PI优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞样本设置：1.空白对照：辅助判断管，即不加AnnexinV/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。2.阴性对照：未诱导的，AnnexinV/PI双染，细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。3.单阳样本：诱导凋亡，AnnexinV单染，用来调补偿4.单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿注意事项：1.细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性2.贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子BDAnnexinV流式检测试剂盒KitCatno.AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitI556547AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitII-Containsunlabeledrecomb.AnnexinV556570AnnexinV:PEApoptosisDetectionKitI559763提供FITC,PE,APC,CY5,CY5.5,BDHorizonV450,BDHorizonV500等多种荧光标记的AnnexinV以及纯净的AnnexinV。AnnexinV检测常见问题1.是否AnnexinVKits可以检测小鼠或其他物种?•AnnexinV试剂盒可以检测多种属2.这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织?•No.上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的样本建议用免疫荧光技术(Cat.No.550911)3.是否与细胞表面标记兼容?CD11B/MAC-1LY-71•只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做2.线粒体水平的检测激活Caspase9—激活Caspase3—启动细胞凋亡•凋亡与线粒体膜电位的去极化相关•BDMitoscreen(JC-1)Cat#55130225tests•JC-1:可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素•原理：JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（FL-2Channel）；细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降低，JC-1以单体形式存在于胞浆内，荧光强度减弱甚至消失，故用荧光信号的变化判别凋亡的发生。p操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测2.线粒体水平的检测JC-1检测结果流式图JC-1(Fl-1)JurkatTCellsMouseThymocytesControlStaurosporineCamptothecinFasmAbR1R2R1R2R1R2R1R2R1R2R1R2ControlJC-1(Fl-2)3.凋亡相关酶的检测-Caspase•背景知识–细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）–Caspase3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase3激活==细胞凋亡–检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。JurkatT-Cells6µMcamptothecinfor4huntreatedCaspase-3data（IHC）Caspase-3data（FCM）JurkatT-CellsMouseThymocytesFITCActiveCaspase-3ApoptosisKitCatNo.FITCActiveCaspase-3ApoptosisKit550480PEActiveCaspase-3ApoptosisKit550914Caspase-3KitsPARPcleaved–Caspase3水解产物•PARPs：一类由DNA链断裂而被激活的DNA修复酶。PARP可以被Caspase-3水解成两个大小分别为24-和89-kDa的片段而失活•PARPcleaved是凋亡细胞中活化的Caspase-3水解产物，代表Caspase酶失去活性•细胞凋亡的标志Hela细胞A.未处理组B.星孢菌素处理组裂解的PARPcleaved阳性Jurket细胞用不同浓度的喜树碱处理结果PARPcleaved–Caspase3水解产物化疗前后胃癌活检标本中PARPCleaved+细胞4.细胞核DNA检测•凋亡晚期—DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段。•检测方法—Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋亡百分比—末端转移酶标记技术细胞核DNA检测原理：APO-BrdUTdT:脱氧核糖核苷酸末端转移酶BrdUTP的渗入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高TUNEL法:流式分析晚期凋亡APO-DIRECT™KIT50testscat.556381PartA(storeat4℃)PartB(storeat－20℃)PI/RnasestainingbufferFITC-dUTPReactionbufferNegativecontrolcellsRisingbufferPositivecontrolcellsWashbufferTdTEnzymeAPO-BrdU™KIT60testscat.556405PartA(storeat4℃)PartB(storeat－20℃)FITC-LabeledAnti-BrdUmAbBr-dUTPPI/RnasestainingbufferReactionbufferNegativecontrolcellsRisingbufferPositivecontrolcellsWashbufferTdTEnzymeTUNEL法:流式分析晚期凋亡24总结BD流式系列课堂-1：研究细胞生命活动的流式解决方案DNA含量与细胞周期检测原理利用特殊的荧光染料(PI等)与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。PI染色细胞周期的样本制备样本来源•培养的细胞、血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。•新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜标本。•标本的细胞数应106注意事项：获得单个细胞，尽量避免DNA的降解•样本最关键的就是减少碎片（EDTA/不可过度吹打/离心rpm）•PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解•PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂•污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌细胞周期样本检测注意事项：1.进样速度：一般检测细胞浓度调整为2E5–2E6/ml，进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快2.仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽3.排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W）通过电压脉冲信号的宽度和面积区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果细胞周期样本检测DNA检测的常用术语1.变异系数（CoefficientofVariation，CV）•表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。•通常由G0/G1峰的CV来反映【%CV=（SD/mean）x100】•影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变异。P.S.CV在5%的精度足够，CV值的可信度在8%以内，但要视样本的固定和染色方法而定DNA检测的常用术语2.DNA指数（DNAindex，DI）和倍体（Ploidy）•DI(DNAindex)：DNA指数，指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均荧光强度与正常二倍体G0/G1峰的平均荧光强度（Mean）之间的比值。DI为1意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。•倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中为描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为0.85-1.15为近二倍体，DI为1.9-2.1的细胞为四倍体（CV为5%时），DI2.1的为多倍体，其余DI值均为非整倍体。一般把非二倍体统称为异倍体。结果分析•CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手工进行参数统计和计算；•推荐使用ModFit分析软件（分析如下：）1.打开软件；2.在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细胞，必要时可以设两个门。3.在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图•备注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。结果分析正常细胞周期分析肿瘤组织中的各种DNA倍体肿瘤细胞细胞周期与DNA倍体分析应用FACS应用：辅助肿瘤早期诊断与鉴别诊断药物对细胞周期的影响更多的产品或技术信息，详见…