质粒提取鉴定及保存,详细版

质粒提取、鉴定及保存（1）质粒的提取(Tiangen质粒提取试剂盒)：a）挑菌：选取培养板中大小中等的单个菌落，消毒牙签接种到10ml摇菌管中，其中含有卡那霉素的LB约5ml，37°C，220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。b）取上述2.0ml培养液，于常温下12000rpm离心1分钟，弃上清，干燥沉淀。c）加入250µl溶液P1(配有去RNA酶，4°C保存)，涡旋振荡，完全悬浮细菌，不能留有沉淀，否则会影响裂解。d）加入250µl溶液P2，快速上下颠倒8次，常温静置3分钟，可见混合液逐渐变清、粘稠，表示已充分裂解。e）再加入350µl溶液Ⅲ，快速上下颠倒8次，可见白色絮状物出现。f）常温12000rpm离心10分钟，所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀，静置3分钟，12000rpm离心1分钟。g）加入500µl溶液PD，12000rpm离心1分钟。h）加入600µl溶液PW，12000rpm离心1分钟；此步骤再重复1次；弃废液后空管再次12000rpm离心2分钟。i）于超净台通风干燥，放置2-5分钟，加入33µl已加热至65°C的已灭菌的ddH2O，室温静置3分钟，12000rpm离心2分钟，得到相关质粒DNA，测浓度，-20°C保存备用。（2）质粒鉴定及保存取100ng上述提取的质粒，进行酶切（反应体系见前），随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定（方法同前所述），最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。如测序正确，用50%灭菌甘油300µl+700µl的菌液，标记于-80°C保存备用。11）质粒或PCR产物纯化（胶回收）（1）琼脂糖电泳酶切或PCR相关产物。（2）在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段，割取要迅速，以避免紫外线对DNA的损伤，但注意尽量割取目的片段，减少无目的片段的凝胶量，以便提高纯化回收效率。（3）用天平称先称区空EP管重量，再称取含有凝胶的EP管重量，计算得到凝胶重量（mg），加入等量体积（µl）Bindingbuffer（如1mg=1μl）。（4）将含有凝胶的EP管置入60°C恒温水浴箱中融化凝胶，持续8-10min，间或拿出摇匀，以确保完全凝胶溶解。（5）将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上，室温下静置吸附3分钟。（6）将纯化柱12000rpm离心1分钟，弃超滤液，必要时可将超滤液重新离心1次可提供纯化效率；再次加入100µlBindingbuffer，12000rpm离心1分钟。（7）加入700µlWashbuffer（事先已经加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，弃超滤液；空管12000rpm离心2分钟。（8）纯化柱置于1.5毫升干净离心管中，于超净台通风干燥5分钟。（9）加入30µl已加热至65°C的已灭菌的ddH2O，室温静置3分钟，12000rpm离心2分钟，得到相应的DNA片段，测浓度，-20°C保存备用。