第三节动物细胞工程

第三节动物细胞工程1动物细胞特点•无细胞壁•倍增时间长，生长缓慢•需氧量少，对搅拌敏感•聚集体形成•原代细胞培养50代即开始退化动物细胞间的连接方式•紧密连接•间隙连接•隔壁连接•中间连接•桥粒连接2动物细胞培养定义•动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。•是动物细胞工程的基础。3发展历史•1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞4生长特性•贴附生长型如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞•悬浮生长型细胞如血液白细胞，淋巴组织细胞等5体外培养细胞基本技术•体外培养特点•体外培养工具•体外培养条件•体外细胞生长增殖过程•培养方法•大规模培养技术5.1体外培养特点•营养条件苛刻•适应性差,敏感•培养时间长，易污染培养工具•器皿为各种类型的培养瓶、培养皿、培养室、小室等•载体：空心纤维和微珠5.2体外培养工具•空心纤维•微球5.3体外培养条件•温度，37度•pH：7.2-7.4•气体，氧，二氧化碳，氮气•营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供动物细胞培养基•天然培养基：主要有血清，组织提取液、鸡胚汁•合成培养基•无血清培养基动物细胞培养必需的溶液•平衡盐水•培养基pH•细胞消化液：把组织解离成分散细胞胰蛋白酶消化液和EDTA溶液抗生素溶液5.4体外细胞生长增殖过程•原代培养期•传代培养期•衰退期5.5培养方法•悬滴：最早由Harrison1907年创立•旋转管：•灌注小室•培养瓶•培养板原代培养与传代培养技术•1）组织快培养首先从机体获得组织快，然后放入一个培养皿中用Hanks液洗，用小剪刀剪成1mm3的组织快，加入少许培养液，塞上瓶塞置于37度培养箱培养，成单层后做传代培养。为促进细胞帖壁，也可以瓶内壁涂一层血清。组织消化培养过程•取材分离和组织消化•培养过程接种、培养-常规检查传代培养技术•当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展成片，占满器皿表面。这时需要对其分离培养，这一操作过程称为传代。•（1）吸取培养瓶内旧培养液。•（2）加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。•（3）2-5min后检查，如有细胞间隙变大或细胞质回缩现象，终止消化。•（4）吸出消化液，加入Hanks液。•（5）用吸管轻打瓶壁，使细胞脱落成悬浮液•（6）重新接种贴壁培养技术•贴壁培养的材料：•1）玻璃•2）塑料3）金属4）微载体基本操作•1）将培养材料用物理或生物化学法分散成细胞悬浮液。•2）过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。•3）放入CO2培养箱培养。生长过程及优点•游离期•吸附期•繁殖期•退化期优点：1）贴壁培养比较容易更换培养基2）容易采用灌注培养，提高细胞密度。3）更有效表达同一产品。4）方便地调节培养液和细胞比例。5）易于观察细胞生长状况。5.6大规模培养技术•悬液培养，使用微球载体•微载体培养•多孔载体培养•微囊化培养•中空纤维法动物细胞生物反应器培养•动物细胞培养用生物反应器种类：微载体式中空纤维式：最经典，最常用灌注培养式旋转壁式6动物细胞培养的应用1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等，酶类，激素，病毒杀虫剂•（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。•（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。•（3）用于检测有毒物质•（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据动物细胞培养培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等动物细胞动物细胞原代培养分裂10次细胞株传代培养分裂50次(细胞系)(细胞株)细胞系无限分裂遗传物质未发生改变遗传物质发生改变无限增值植物体培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白培养目的葡萄糖动物血清蔗糖植物激素液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目细胞株、细胞系植物体培养结果分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株培养目的葡萄糖动物血蔗糖植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞融合诱导动物细胞融合的方法物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的动物病毒动物细胞融合的用途制备单克隆抗体主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较采用此方法可以将两个不同种、属的动物优点集中在一起，产生具有双亲优点的可繁殖的杂种动物。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒6.1单克隆抗体1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。•每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。（1）提出问题：从动物血清中分离抗体的方法产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏（2）设计方案：由于每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，就可以产生单克隆抗体。由于B淋巴细胞不能无限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可达到目的。杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图单克隆抗体的应用①在基础理论研究中具有重要意义②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性。③生物导弹组织工程•应用细胞生物学和工程学的原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖，扩增，然后移植到人体内所需的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的。6.2动物克隆生物繁殖后代通常是以精、卵细胞结合的有性生殖方式进行。通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性繁殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖。1981年Illmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，1984年Willadsen用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊。英国PPI生物技术的罗斯林（Roslin）研究所的维尔穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名权威杂志《Nature》宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“多莉(Dolly)”的消息。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国《Science》周刊评出的1997年十大科学发现的榜首。绵羊B乳腺细胞核易核卵融合卵绵羊C子宫多莉植入植入生产克隆多莉羊示意图取出未受精卵去核电激体外胚胎发育绵羊A多莉克隆猴(1)遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物(人)生长、发育、衰老和健康等机理的研究；(2)有利于大量培养品质优良的家畜;(3)经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官；(4)科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆,即借腹怀胎的新领域,这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。克隆技术将对21世纪产生的重大影响克隆动物的研究意义1.用于生物学和医学研究的实验动物2.改良动物品种3.治疗人类疾病4..保护濒危动物缺点:1.克隆技术却是一个降低繁殖力的方法；2.克隆动物在遗传上是全等的，一种特定的病毒或其它疾病的感染，将会带来灾难；3.会扰乱物种的进化规律，干扰性别比例。6.3干细胞工程