规范的遗传学试验指导(13)

《—遗传学—》实验指导书王娜编写适用专业：生物技术江苏科技大学生物技术学院2015年9月I前言根据生物技术的学科特点，结合教学培养方案的要求，编写了本书。目的是为了使学生更好地掌握遗传学的基本理论和有关的研究技术，因而在内容上尽可能配合遗传学的教学。通过本实验课程学习，一方面加深学生对普通遗传学的基本理论和基本规律的感性认识，另一方面提高学生的动手能力，使其掌握基本的试验方法与技能，提高学生对实验结果的分析能力和动手能力，为今后的学习和科研工作打下扎实基础。在实验过程中要求学生养成科研工作的良好作风和工作习惯，逐步培养他们运用所掌握的理论知识解决实际问题的能力。II目录实验一果蝇杂交综合实验···············································1实验二巴尔小体的观察及与性别和疾病的关系分析···········10实验三多倍体的诱发及根尖细胞有丝分裂标本的制备········14实验四人类指纹和对苯硫脲尝味能力的遗传分析··············17实验五Hardy-Weinberg遗传平衡定律·····························221实验一果蝇杂交综合实验实验学时：8实验类型：综合实验要求：必修果蝇的饲养及基本形状的观察一、实验目的通过本实验的学习，让学生掌握果蝇生活史、基本形态观察、培养方法、原种保持等等的基本知识，为后述实验服务。二、实验条件1、实验器材：恒温培养箱、天平、电炉，等。2、实验材料：玉米粉、白糖、酵母、琼脂条三、实验内容果蝇具有生活史短、繁殖率高、饲养简便等特点，是研究遗传学的好材料，尤其在基因分离、连锁、交换等方面，对果蝇的研究更是广泛而充分。1、果蝇的生活史果蝇属于昆虫纲、双翅目，与家蝇是不同的种。它的生活史包括卵－幼虫－蛹－成虫。果蝇的生活史周期长短与温度关系密切，30℃以上的温度能使果蝇不育和死亡，低温则使它生活周期延长，同时生活力也减低，果蝇培养的最适温度20～25℃。10℃15℃20℃25℃卵－幼虫幼虫－成虫57天18天8天6.3天5天4.2天从表中可以看出25℃时，从卵到成虫约10天；在25℃时成虫约活15天。果蝇一般是培养在恒温箱内，盛夏时，要注意降温。果蝇有雌雄之分，幼虫期区别较难，成虫区别容易。雄性的腹部环纹5节，末端钝而圆，颜色深。第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流苏，称性梳(sexcombs)。雌性腹部环纹7节，末端尖，颜色浅，跗节前端无黑色鬃毛流苏。2、果蝇的繁育2果蝇在水果摊或果园里常可见到，但它并不是以水果为生，而是食生长在水果上的酵母菌，因此实验室内凡能发酵的基质，均可作为果蝇饲料。目前果蝇饲料较好的配方如下：A：糖6.2克，加琼脂0.62克，再加水38毫升，煮沸溶解。B：玉米粉8.25克，加水38毫升，加热搅拌均匀后，再加0．7克酵母粉。A和B混合加热成糊状后，加0.5毫升丙酸，即可分装到培养瓶中。除了以上的饲料外，常用的还有米粉饲料和香蕉饲料。1．米粉饲料的配制：琼脂0.9—2.5克加入100毫升水中，加热煮沸溶解；再加10克红糖，待溶解后将8克米粉（或麸皮）倒入正在煮沸的琼脂—红糖溶液中去，不断搅拌煮沸数分钟，待成稀粥状后即可分装使用。2、香蕉饲料配制：将熟透的香蕉捣碎，制成香蕉浆（约50克)。将1.5克琼脂加到48毫升的水中煮沸，溶解后拌入香蕉浆，再煮沸后即可分装。以上两种饲料容易生霉菌，必要时需加少量防霉剂。培养果蝇的饲养瓶，常用的有牛奶瓶，大中型指管，用纱布包裹的棉花球作瓶塞(有条件的地方可改用泡沫塑料作瓶塞)。饲养瓶先消毒，然后倒入饲料(2厘米厚)，待冷却后，用酒精棉擦瓶壁，然后滴入酵母菌液数滴，再插入消毒过的吸水纸，作为幼虫化蛹时的干燥场所。3、果蝇处理对果蝇进行检查时，可用乙醚麻醉，使它保持静止状态。因果蝇对乙醚很敏感，易麻醉，麻醉的深度看实验要求而定(作种蝇以轻度麻醉为宜，做观察可深度麻醉，致死也无妨。果蝇翅膀外展45℃角表示已死亡)。麻醉后的果蝇放在白瓷板上检查，完毕后倒入煤油或酒精瓶中(死蝇盛留器)。4、原种培养在作为新的留种培养时，事先检查一下果蝇有没有混杂，以防原种丢失。亲本的数目一般每瓶5—10对，移入新培养瓶时，须将瓶横卧，然后将果蝇挑入，待果蝇清醒过来后，再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在培养基上。原种每2—4周换一次培养基(按温度而定)，每一原种培养至少保留两套。培养瓶上标签要写明名称，培养日期等，作为原种培养，可控制到10一15℃，培养时避免日光直射。5、实验交配果蝇雌体生殖器官有受精囊，可保留交配所得的大量精子，能使大量3的卵受精，因此在做品系间杂交时，雌体必须选用处女蝇。雌蝇孵出几小时内不会交配，所以把老果蝇除去后，几小时内所收集到的雌体必为处女蝇。由于雌蝇两天内不产卵，所以雄蝇可直接放到处女蝇培养瓶中(也可以放在盛有食物的小瓶中暂养两天，直到雌蝇将要产卵时放回培养瓶中)。贴好标签，写好交配日期，当子蝇即将孵化出来以前，也就是说23℃培养7—9天，倒'出亲本，以免和亲代混淆。另一方面应该注意，杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内(因为再晚些时，F2也可能有了)。单因子实验（分离定律）一、实验目的1、理解分离定律的原理；2、掌握果蝇的杂交技术；3、记录交配结果和掌握统计处理方法；4、为后述的综合性实验做好基础。二、实验内容在学生掌握培养基制备的基础上，对果蝇进行挑选，在合适温度下培养后，进行分析统计。三、实验原理、方法和手段一对基因在杂合状态中保持相对的独立性，而在配子形成时，又按原样分离到不同的配子中去。理论上配子分离比是1：l，子二代基因型分离比是1：2：l，若显性完全，子二代表型分离比是3：1。这就是分离定律。四、实验条件1、实验材料：黑腹果蝇品系长翅果蝇（+／+）和残翅果蝇（vg／vg）。2、用具：麻醉瓶，白瓷板，海绵，放大镜，毛笔，镊子，培养瓶。3、药品：乙醚五、实验说明1、性状特征：野生型果蝇的双翅是长翅(+／+)，翅长过尾部。残翅果蝇(vg／vg)的双翅几乎没有，只有少量残痕，无飞翔能力。长翅对残翅显性完全。2、交配方式：用长翅果蝇与残翅果蝇交配，得到子一代（F1）都是长翅，子一代雌雄个体间相互交配，子二代产生性状分离，出现两种表型，呈3：1之比。现以长翅雌蝇与残翅雄蝇交配为例，在这个实验中，子一代基因型为+／vg，可以产生两种配子，+和vg，各占1／2。雌雄都是这样。因4为长翅对残翅显性，+／+和＋／vg基因型都表现出长翅性状。只有vg／vg才呈残翅。所以F2代群体中，长翅与残翅比为3：l。其中长翅中有2／3是杂合体＋／vg，l／3是纯合体+／+，但在表型上无差别。F2代群体越大，越接近理论比。实得比数符合理论比数的程度如何，需要进行X2测验。六、实验步骤1、收集处女蝇：由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可取留大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。由于孵化出的幼蝇在12小时内(更可靠是8小时)不交尾，因此必须在这段时间内把雌雄蝇分开培养，所得的雌蝇即为处女蝇。2、选野生型长翅和残翅果蝇为亲本，做正交和反交组合。雌蝇一定要选处女蝇。处女蝇在实验前2—3天陆续收集，数目多少根据需要而定。3、把长翅果蝇和残翅果蝇进行杂交，正交与反交各一瓶。即：长翅(♀)×残翅(♂)；长翅(♂)×残翅(♀)。(1)把长翅处女蝇倒出麻醉，挑出5—6只移到杂交瓶中。(2)其次把残翅倒出麻醉，在放大镜下，白瓷板上仔细挑出5—6只雄蝇，移到上述杂交瓶中。(3)贴好标签：杂交瓶放到23℃温箱中培养。反交与正交方法一样。4、7—8天后，倒去亲本果蝇。5、再过4—5天，F1成蝇出现，观察Fl翅膀，连续检查2—3天。6、麻醉Fl成蝇，移出5—6对果蝇，放到另一培养瓶内。这里雌蝇无须处女蝇，在23℃温箱中培养(反交同样做一瓶)。7、7—8天后，移去Fl亲本。8、再过4—5天，F2成蝇出现，开始观察。连续统计7—8天。七、实验结果F1结果观察结果统计日期长翅(♀)×残翅(♂)长翅(♂)×残翅(♀)长翅数残翅数长翅数残翅数合计5F2结果观察结果统计日期长翅(♀)×残翅(♂)长翅(♂)×残翅(♀)长翅数残翅数长翅数残翅数合计X2测验长翅（正反交合并）残翅（正反交合并）合计试验观察数（O）预期数（C）偏差（O－C）（O－C）2/C自由度＝n－1＝X2＝∑（O－C）2/C＝查X2表果蝇的伴性遗传一、实验目的1、记录交配结果和掌握统计处理方法2、正确认识伴性遗传的正、反交的差别二、实验内容果蝇的伴性遗传是在学习单因子实验的基础上进行的。本实验综合了多个遗传知识点：1、果蝇雌雄的鉴定方法和麻醉方法；2、果蝇培养基的配制方法；3、认识伴性遗传与常染色体遗传的异同；4、通过本实验让学生正确认识伴性遗传的正、反交的差别以及记录交配结果；5、掌握基本的统计处理方法。三、实验原理、方法和手段6位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的基因不同，它的传递方式与雌雄性别有关，因此称为伴性遗传。果蝇的性染色体有X和Y两种，雌蝇为XX，是同配性别；雄蝇为XY，是异配性别。四、实验条件1、实验材料：黑腹果蝇品系野生型（红眼）和突变型（白眼，在X染色体上）。2、实验器具和药品：双筒解剖镜，麻醉瓶，白磁板，毛笔，镊子。五、实验说明交配方式：A：♀X+X+×XWY♂B：♀XWXW×X+Y♂↓↓F1：X+XW×X+YF1：X+XW×XWY↓↓F2：X+X+X+XWX+YXWYF2：X+XWXWXWX+YXWY若A为正交，Fl代♀、♂都为野生型，Fl相互交配得F2代，则♀都是野生型，♂则野生型和白眼各占一半，比例为l：1。B是A的反交，Fl代与A不同，♀为野生型，而♂为白眼。F1相互交配得F2代，♀的红眼与白眼比例为l：1，♂的红眼与白眼比例也是1：l。注意：1、常染色体性状遗传的正、反交所得子代♀、♂性状相同，而伴性遗传则有不同。2、在进行伴性遗传实验时，也有例外个体产生，这是由于两条X不分离造成的(B杂交组合)，F1中出现了不应该出现的♀性白眼，但这种情况极为罕见，约几千个体中有一个。六、实验步骤1、收集处女蝇2、准备好培养基，按正、反交组合，把已麻醉的红眼♀、白眼♂和白眼♀、红眼♂分别放入不同瓶内进行杂交，贴上标签。6—7天后，见到有Fl幼虫出现，即除去亲本果蝇(一定要除干净!)。3、再过3—4天，观察Fl成蝇的性状。(正、反交有什么不同?眼色和性别的关系如何?)4、所出现的Fl♀、♂麻醉后，挑3—5对果蝇换入新的培养基继续饲养(此7处无需处女蝇，为什么?)。两组合后代不能混合，应分别培养。5、6—7天后又需除干净Fl代亲本果蝇。6、再过3—4天，F2代成蝇出现，麻醉后倒在白瓷板上观察眼色和性别，进行统计。7、每隔1—2天统计一次，累积6—7天数据。七、实验结果A组合：（正交）红眼♀×白眼♂F1代观察结果统计日期各类果蝇的数目红眼♀红眼♂B组合：（反交）白眼♀×红眼♂F1代观察结果统计日期各类果蝇的数目红眼♀白眼♂A组合：（正交）红眼♀×白眼♂F2代观察结果统计日期各类果蝇的数目红眼♀白眼♀红眼♂白眼♂8合计百分比B组合：（反交）白眼♀×红眼♂F2代观察结果统计日期各类果蝇的数目红眼♀白眼♀白眼♂白眼♂合计百分比X2测定：X2＝∑（观察值－理论值）2/理论值＝根据X2测定，查X2表，若P＞5％，说明观察值与理论值之间的偏差是没有意义的，也就是说，可以认为观察值是符合假设的。具体对这个试验来说，所得到的试验结果应该是符合伴性遗传的架设，也就是说眼色的这对性状是由于位于性染色体上X上的一对等位基因控制的。附录一：学生实验报告基本内容要求用学校统一规定的实验报告簿，用来做预习报告、实验记录和实验报告，要求这三个过程在一个实验报告中完成。1、实验预习在实验前每位同学都需要对本次实验进行认真的预习，并写好预习报告，在预习报告中要写出实验目的、要求，需要用到的仪器设备、物品资料以及简要的实验步骤，形成一个操作提纲。对实验中的安全注意事项及可能出现的现象等做到心中有数，但这些不要求写在预