第二十一章章基因工程8版-上课

1DNA重组和重组DNA技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章2第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNature3DNA重组(conjugation)(transformation)(transduction)(transposition)(homologousrecombination)(site-specificrecombination)4第二节重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone5DNA1865G.J.Mendel1944O.T.Avery19531961。DNADNADNA6DNA贮存遗传信息7复制复制转录转录翻译翻译重组DNA技术8DNA1972,Boyer,EcoR1972,Berg,SV40EcoR,T4DNA,19801973,Cohen,R6-5(Kan+)pSC101(tet+)EcoR,T4DNA91974,CohenBoyer,pSC101E.coli,mRNA1974,Berg,NIH,DNA1976,NIH,DNA1977GenetechDNA1980DNA19971011DNA12一、重组DNA技术相关概念(clone):(cloning)DNA克隆(molecularclone)DNA13DNADNADNADNAmolecularcloningDNADNAcloninggeneticengineeringDNA14构建重组体导入宿主细胞筛选15Definition:RecombinantDNA/Genecloning/DNAcloning重组DNA技术是利用分子生物学技术在体外将不同来源的DNA片段连接成一个重组DNA分子，并将重组DNA分子转入合适的宿主中，进行复制或表达的过程。限制性位点插入片段1/2的重组载体转化复制、扩增、细胞分裂细菌基因组供体DNA限制性片段16片段1的克隆17二、DNA克隆所需的原料和工具包括：目的DNA:想研究的DNA片段或基因运输工具:质粒或病毒载体剪刀：限制性内切酶胶水:DNA连接酶宿主：原核/真核细胞18DNA工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基19(restrictionendonuclease)(RE)DNA,DNAGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG++BamHⅠ定义：20DNADNA来源和作用：限制-修饰系统限制性核酸内切酶细菌染色体甲基化保护的限制性位点入侵的噬菌体DNA被限制性内切酶切割21分类：I、III：有甲基化酶活性，需ATP，Mg2+，SAM，距识别位点数千/几十碱基处随机切割II：切割序列特异性，无甲基化酶活性，无需ATP—工具酶22命名：EcoREscherichiacoliRR23——(palindrome)GGGGAATTCCCCCCCCTTAAGGGG5’3’3’5’24BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG++GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG++平端切口粘端切口25EcoRⅠ5'3'-GAATTC-5'3'-CTTAAG-5’突出末端GCTTAAAATTCG++PstⅠ5'3'3'-GACGTC--CTGCAG-5'3’突出末端CTGCAGGACGTC++5’5’5’5’3’3’3’3’26EcoRI与其靶序列的相互作用GAAGAATTCTTCCTTCTTAAGAAG27RE磷酸二酯键28粘末端在构建重组/嵌合DNA分子时特别有用5’5’37℃分子内连接分子间连接低温29用相同的酶切割不同来源的DNA分子在重组DNA技术中使用昀多分子间连接低温连接30GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGBamHI不同的酶切割不同来源的DNA分子，产生的不同粘末端无法连接在一起。另外，任何两个平末端之间均可连接31GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG++BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG++BstⅠ同裂酶/同功异源酶：32DNA(compatibleend)BamBamHHⅠⅠBgBgllⅡⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++++ATCTAGGATCTA同尾酶33DNA连接酶:另一重要的工具酶磷酸二酯键连接酶34DNA连接酶催化互补粘末端/平末端之间的共价连接，形成3’,5’磷酸二酯键。DNA连接酶2ATPSticky-endligationBlunt-endligation粘末端连接平末端连接353636DNA连接酶可以在体外将两个DNA片段连接在一起，产生新的重组分子。使用DNA连接酶将DNA片段插入细菌质粒中37缺口裂口连接连接38DNA (targetDNA)DNA(genomicDNA)cDNA(complementaryDNA)39（三）基因载体DNA(cloningvector)(expressionvector)40(cloningvector)DNA(expressionvector)DNA411.克隆载体ORIDNAselectionmarker-lacZRE—multiplecloningsitesMCSRE克隆载体应具备的基本特点42insertBamHIreplication43:1.:DNA2.:3.():/DNA:4.:RNA5.6.7.PolyA44(1)质粒(plasmid)4546474363bppBR322质粒物理图谱克隆载体4849多克隆位点Multiplecloningsite(MCS)EcoRⅠ消化的克隆载体DNA连接酶人工接头502686bp氨苄青霉素抗性复制起始点多克隆位点半乳糖苷酶51乳糖操纵子结构*结构基因:Z,Y,A，分别编码β-半乳糖苷酶,透酶,转乙酰酶*启动序列:RNA聚合酶结合位点*操纵序列:阻遏蛋白结合位点*CAP位点:CAP结合位点*调控基因I:编码阻遏蛋白调控区乳糖操纵子操纵序列启动序列CAP位点调控基因52‐某些质粒载体如pUC19携有lacZ’基因，编码β-半乳糖苷酶的α片段，即N端146个氨基酸残基。突变型大肠杆菌可表达该酶的ω片段，即羧基端。单独存在的α、ω片段均无β-半乳糖苷酶活性。当携有lacZ’基因的克隆载体导入突变型大肠杆菌，共表达α、ω片段，二者相互作用，形成完整的β-半乳糖苷酶活性。这种相互作用叫做α-互补53氨苄青霉素抗性半乳糖苷酶复制起始点多克隆位点54分型：松弛型质粒与严紧型质粒松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有10个左右质粒.这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下严紧型质粒的复制受到严格的控制,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1～2个质粒55DNAgtcDNAEMBL（2）噬菌体(phage)M13DNAlacZM13mp用于制备DNA测序时的单链模板和核酸探针）pUC56cosmid(yeastartificialchromosome,YAC)(bacterialartificialchromosome,BAC)（3）其他克隆载体575859一个大肠杆菌表达载体(SD)60真核表达载体—穿梭载体：可在两种不同的宿主细胞中存活或复制61: 1.易于接受重组DNA.2.不含载体具有的筛选标志.3.不限制重组DNA的复制.4.不含限制性内切酶和重组酶.5.包括真核及原核细胞。62分：分离目的DNA及载体DNA切：相同的限制性内切酶分别切割载体DNA和目的DNA.接：DNA连接酶共价连接目的DNA和载体DNA形成重组DNA.转：重组DNA导入宿主细胞复制.筛：筛选含有重组DNA的宿主细胞.(表)：克隆基因表达RNA/蛋白63DNA64①从基因组DNA中直接分离_+markerssamples限制性内切酶切割电泳分离65②化学合成法由已知aa序列逆推可能的DNA序列已知核苷酸序列66化学合成法获取目的基因：小分子肽类/aaDNA67•DNA(genomicDNAlibrary)•cDNA(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)③从基因文库筛选目的基因68基因组DNA文库DNADNA•••69Definition提取组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌DNADNADNA70DNA5~20kb•EMBL•gtcDNAEMBLgt71λ噬菌体DNA•一种感染大肠杆菌的噬菌体•线性双链DNA基因组,48502bp.•在宿主细胞内自主复制溶菌生活周期727374BamHⅠ5'3'-GGATCC-5'3'-CCTAGG-Sau3AⅠ5'5'3'3'-NGATCN--NCTAGN-置换型载体75限制性内切酶消化基因组DNA相同的酶消化载体DNA连接二者形成重组DNA分子76将重组DNA分子导入宿主菌空菌获取其他基因获取目的基因77接种琼脂平板形成文库78从基因文库筛选克隆目的基因79表型筛选抗体筛选DNA杂交（探针）表型筛选抗体筛选DNA杂交cDNAcDNAcDNAcDNA文库••••80DefinitionmRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制cDNAAAAATTTTAAAADNATTTT8182向双链cDNA末端添加EcoRⅠ接头EcoRⅠ甲基化酶EcoRⅠ消化产生粘末端甲基化阻断cDNA双链上的EcoRⅠ位点T4DNA连接酶添加EcoRⅠ接头83PCR84•DNA•858687(1)(2)—(3)1.粘性末端连接88T4DNA15ºC++BamHGCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCGDNABamHGCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG1892GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRBglAATTCGATCTAGEcoR+BglGCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA15ºCGAGCTTCTTAAAEcoRIBgl载体双酶切90(terminaltransferase)DNA(3)-①同聚物加尾连接915´3´3´5´DNA5´3´3´5´5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´3´3´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶+dATP+dTTP5´••••AAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAA92(3)-②人工接头(linker)连接93CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ94(3)-③PCR获取目的基因的同时加入单酶切位点质粒粘末端95(3)-③PCR获取目的基因的同时加入双酶切位点962.平端连接••3