第二章基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶分类：限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）RNaseA1.水解酶类核酸酶RNaseT1RNaseHDNaseⅠS1核酸外切酶（Exonuclease）大肠杆菌DNA聚合酶（DNAPolⅠ)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（KlenowFragment|）2.DNA聚合酶类嗜热DNA聚合酶（Taq酶）DNA连接酶(Ligase)反转录酶（ReverseTranscriptase)小牛肠碱性磷酸酶(CIP)3.修饰酶类细菌碱性磷酸酶(BAP)T4噬菌体多核苷酸激酶（T4PhagePolynucleotideKinase)鼠源禽源（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应条件一、限制性核酸内切酶由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现大肠杆菌B大肠杆菌KEOP=1EOP=1EOP=10-4EOP=10-4EOP成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现限制和修饰现象限制—修饰的酶学系统酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。1962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限制修饰系统。1968年发现Ⅰ型内切酶;1968年美国的H.O.Smith发现Ⅱ型内切酶;1970年美国的O.Nathans（内申斯）用Ⅱ型酶制备了肿瘤基因;1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。概念:限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。EcoRⅠ（酶名称）:EscherichiaColiRnisⅠ属名种名株系编号（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源DNA的防御机制。几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamHI、BclI、BglII和XhoI是一组同尾酶。平齐末端带5’－P端的黏性末端带3’－OH和5’－P端的平末端例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，识别顺序都是5’……C|CGG……3’3’……GGC|C……5’如果其中有5’-甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能够切割，MspI能切割。同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A.B,如图：MobIBamHIBglII5’…NGATCN…3’5’N…GGATCC…N3’5’N…AGATCT…N3’3’…NCTAGN…5’3’N…CCTAGG…N5’3’N…TCAAGA…N5’5’…NGATCC…N3’5’N…GGATCT…N3’3’…NCTAGG…N5’3’N…CCTAGA…N5’5’N…GATCC…N3’5’…NGCATCT…N…3’CTAGG…N5’CGTAGA…N…5’A:可被MobI识别切割，但不被B:重组DNA,-不能被上述酶识别BamHI识别切割。与切割。注意限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援DNA,只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNA的重组。在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的那种酶(MobⅠ)进行酶切鉴定。在B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种酶鉴定。通常选A的情况。4.不具有甲基化功能II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。5.对单链DNA的切割切割效率较低。酶活单位一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1gDNA所需要的酶量。（五）限制性核酸内切酶的消化反应酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10×)2.0LddH2O约16.5LDNA0.2~1.0gEnzyme1～2UVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT①反应体系②混匀③最适温度,酶量,时间,反应终止④电泳鉴定结果在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。限制性内切酶的第二活力（Secondaryactivity，又称星号活力）指改变了酶的反应条件，使酶原有的识别特异性的降低。例如：EcoRI的典型特异性是核苷酸序列GAATTC，当改变此酶的反应条件时，他的特异性由原来的6核苷酸降低为四核苷酸AATT。星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性，这些活性在某些情况下可能是有用的，但是很少导致第二识别位点的完全或同等的切割，因此为了避免星活力的出现，所有限制性酶切反应均应在标准条件下，通常反应条件通过缓冲液控制。（六）影响限制性核酸内切酶活性的因素影响酶活性的因素很多，最重要的有：⑴酶纯度⑵DNA的纯度⑶DNA的甲基化程度⑷酶切反应的温度与时间⑸DNA的分子结构⑹限制性核酸内切酶的缓冲液（1）酶纯度引起某些酶活力变化的因素较多，包括甘油的浓度，离子的浓度，PH值，有机溶剂的存在，二价阳离子过高的酶和DNA浓度的比例。（2）DNA纯度铂，酚，氯仿，酒精，EDTA，SDS，盐离子等均影响酶活性。纯度不高，含有蛋白，特别是DNase加入Buffer时因有Mg2+，而激活降解DNA样品，而无特异带。解决办法：扩大反应体积20L—50L延长酶作用时间1h—数小时增加酶用量1u—10u（3）DNA甲基化程度甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割，解决办法是：选用无甲基化酶的突变菌株；使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳动物DNA）。（4）酶切反应的温度与时间所有限制性内切酶均应在标准条件下进行，大多数最适反应温度是37℃，少数耐热TaqⅠ是65℃；SmaⅠ是25℃（30℃）。反应时间与酶量有关。（5）DNA分子的构型不同构型的影响很大：消化超螺旋环状DNA用的酶量大于线性DNA不同位点切割能力不同（6）限制性核酸内切酶的反应缓冲液Mg2+，Tris-HCl，NaCl或KClß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性)BSA（牛血清白蛋白）稳定酶蛋白。（七）其它水解核酸的酶1.水解RNA的核酸酶(Rnase):种类很多介绍五种酶名称来源最适PH作用特点反应式应用RNaseA胰脏7.9切嘧啶产生ApUpCpNpRNA测序3’p嘧啶核苷酸或以其结ApUp+Cp+Np尾的寡核苷酸RNaseT1米曲霉4.5切G产生3’GpGpGpApCpGp同上或以其为结尾的寡核苷酸Gp+Gp+ApCpGpRNaseU2黑曲霉4.5切A产生3‘APGpApCpApAp同上或以其结尾的寡核苷酸片段GpAp+CpAp+ApRNasephy头绒孢菌不切C产生3’Ap,GpApCpUpGp同上3’Gp,3’Up或以其为结尾片段GpApCpUpGpRNaseH大肠杆菌水解DNA-RNA杂交分子中的RNA2核酸酶S来自稻谷曲霉高度特异性于单链核酸的内切酶：可催化单链RNA或DNA，降解成5’单核苷酸。同时也可作用于双链核酸分子的单链区（小到一个碱基）。作用：测定杂交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的杂交程度，即使是一对碱基没杂交也能检测到。cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构测定DNA上内含子的位置（一）DNA连接酶的概念与作用机制（二）连接酶种类及特性的比较（三）DNA连接酶作用的特点（四）DNA连接酶的反应条件（五）影响连接反应的因素DNA连接的策略（六）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案二、DNA连接酶及其应用DNA重组的核心技术：DNA片段之间的体外连接——连接酶。（一）DNA连接酶的概念与作用机制环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码。1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。概念：DNA连接酶（Ligase）能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。DNA连接酶的催化反应DNAligase+NAD+/ATP↓酶-AMP复合物↓+DNAAMP-DNA↓相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击↓→AMP3’,5’-磷酸二酯键DNA连接酶连接的作用机制（二）连接酶种类及特性的比较最常用（三）DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有自由3’-OH和5’-P，而且这两个基团彼此相邻；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coliDNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。OHP××是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick.gapNONickOK（四）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶反应体系体系T载体粘末端平末端10×Buffer1μL1/2μL1/2μLvector50ng3-30fmol15