第六章蛋白质工程在食品工业中的应用

第六章蛋白质工程在食品工业中的应用第一节蛋白质工程的概述一、蛋白质工程的概念二、蛋白质工程的研究内容和技术方法三、蛋白质工程技术的发展历史四、蛋白质工程技术的展望一、蛋白质工程的概念随着对生命过程研究与探讨的逐步深入，人们的认识已经不仅仅局限于对生命现象的描述以及对生命本质规律的了解上，人们希望能够在掌握现象与本质规律的基础上，人为的干预生命过程，依照人们自己的意愿改良、改造生物，甚至能够创造自然界所未曾有过的生物新种。生物科学理论和技术的迅速发展，使人们在相关方面的技术能力上达到了一个新的水平，分子遗传学、基因工程、蛋白质结构与功能以及计算机技术的发展，为这一目标的实现打下了坚实的基础。作为生物最基本的功能大分子之一的“蛋白质”，它是几乎所有生物功能的体现者，弄清蛋白质的结构、功能及其两者相互关系的规律，并且定向的改良蛋白质，甚至构建全新的蛋白质分子已成为客观的迫切需要。1982年Winter等首次报道通过基因定位诱变获得改性酪氨酸tRNA合成酶；1983年Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”（蛋白质工程）为题的专论，这标志着一个新的独立学术领域“蛋白质工程”的诞生。一、蛋白质工程的概念蛋白质工程，是以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术，从改变或合成基因入手，定向的改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好的为人类服务的一种生物技术。蛋白质工程是继基因工程以后又一个可根据人们自己的意愿改造天然生物大分子，甚至可以设计和创造全新的非天然的生物大分子的生物技术。蛋白质工程可赋予蛋白质特殊的性质和功能，满足人们在某些特定条件下的特殊需要。选择蛋白质为研究对象，是基于蛋白质具有多种多样的功能，以及它在各行各业的广泛应用，因而会使这一技术更具有实际价值和开发前景。通常蛋白质工程是以基因操作为基础的，是基因工程技术的发展和延伸，所以又被称为“第二代遗传工程”。一、蛋白质工程的概念天然蛋白质经历了自然界长期的进化过程，已经能够很好的适应生物所处的内外环境，有序而协调的发挥其功能。可以说天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效的发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。但在生物体外的条件下，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧化剂以及极端pH等都会影响酶的作用。蛋白质工程技术针对这一问题，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。二、蛋白质工程的研究内容和技术方法（一）蛋白质工程的研究内容（二）蛋白质工程的主要研究方法（一）蛋白质工程的研究内容1．建立蛋白质工程的研究方法系统2．随机诱变基因库的定向筛选3．研究蛋白质结构与功能的关系4．严格意义上的蛋白质工程1．建立蛋白质工程的研究方法系统这是指在研究某些蛋白质一级结构及其与结构功能元件相互关系的基础上建立起应用蛋白质工程技术的系统。现代蛋白质结构理论研究显示，蛋白质或多肽的立体结构实际上可以是由一些相对稳定的结构元件组装而成，而且蛋白质或多肽的实际功能也与这些结构元件相对应。这就启发我们可以通过对这些蛋白质或多肽的“结构-功能元件”的分解组合，即采用“分子裁剪”的方法获得具有特定结构功能的新蛋白质。在研究过程中不必对整体蛋白质的一级结构及高级结构的关系过于苛求，只要了解这些元件的结构和功能关系就能够满足需要了，这样就大大简化了蛋白质工程的难度，使其操作的可行性增加。实际上，蛋白质在自然界的进化过程也极有可能就是采用这一方式进行的，因为这种方式可以在较短的时间内获得具有新性状蛋白质分子，同时也节约使用有限的遗传信息资源，具有较强的适应能力。1．建立蛋白质工程的研究方法系统对蛋白质工程而言，已知基因的蛋白质也可以很容易地通过基因定位诱变的方法，根据“中性突变”原则，把蛋白质结构功能元件两端的DNA序列修饰成限制性内切酶位点而不改变蛋白质的氨基酸顺序，实现某段基因编码DNA的重组，最后实现对蛋白质结构功能区域的分解重组。这类方法应用较多的是抗体免疫球蛋白分子上的试验，在轻链、重链12个结构域中，有试验将人的抗体分子重链上的抗原互补决定簇换成了小鼠的抗原决定簇，结果小鼠的单抗分子所具备的抗原结合专一性的确转移到人的抗体上了。这就可以用小鼠制备单抗，然后转移给人的抗体，使重组体具有与人的单抗一致的效果，这种制备的方法要比直接制备方法简单方便。有些蛋白质的功能特性与特定的氨基酸侧链有关，这类蛋白质的改造，一般来说不需要以完整的空间结构为基础进行分子设计，只要改变相应的氨基酸种类即可，但是如何进行改变，换成哪种氨基酸，置换后将会对蛋白质结构功能有何影响，则要仔细研究和筛选了。2．随机诱变基因库的定向筛选这一方法是利用目的基因表型具有高效检测筛选系统这一特性，在目标条件下从随机诱变基因库中分离出目标基因，最终获得突变蛋白质。此方法对结构以及结构与功能关系还不很清楚的蛋白质分子也能适用。对许多蛋白质而言，精确结构以及结构与功能关系均不易明确，我们就不能用严格定义的蛋白质工程方法来改造或构建，但有许多蛋白质功能明确，而且有灵敏、快速、高效、简便的功能检测方法。如果我们对目的蛋白质基因或基因上某个区域在体内或体外进行随机诱变，建立突变型基因库，并通过载体系统表达突变蛋白质，用高效检测系统在预定条件下筛选，就可能获得预期的突变蛋白质。这一方法由于具有构思新颖、方法可行、背景知识要求低等突出的优点。3．研究蛋白质结构与功能的关系这是指利用各种方法，包括蛋白质工程的方法，研究和阐明蛋白质分子结构与功能关系，并且尽可能达到定量描述的水平。虽然蛋白质结构与功能关系的研究，不属于严格意义上的蛋白质工程的研究范围，但是应该看到它是蛋白质工程研究的基础，它能为蛋白质的分子改造或分子构建等设计过程提供基本参考数据。该研究内容包括：蛋白质活性中心(催化中心和调节中心)的鉴定、蛋白质中各个关键氨基酸残基在结构和功能中的作用和贡献、蛋白质的折叠过程及其折叠中间体的能量状态和稳定性、蛋白质与蛋白质之间以及蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用和相互识别等。4．严格意义上的蛋白质工程这是指在深入了解某一个蛋白质结构与功能关系的基础上，经过有目标的、严格的分子设计，定向地改造或构建一个具有特定性质和功能的目的蛋白质，这也是蛋白质工程的最终目标，是我们研究的主要方向。严格意义的蛋白质工程内容有：一是对天然蛋白质的改造，包括小改（只改变蛋白质中的少数几个氨基酸残基）、中改（进行适当的分子剪裁和组合）以及大改（进行蛋白质分子的局部重建）。二是完全重新构建全新的蛋白质，即从头设计合成新的蛋白质。对于局部重建的大改和从头设计的构建来说，只有当我们已经基本掌握了蛋白质一级结构与高级机构之间的关系，掌握了蛋白质结构与功能之间相互关系的规律以后，才能真正地把握这一过程。这就需要至少掌握1500个以上的蛋白质的一级结构及其精确的三维空间立体结构数据，并建立相应的数据库，研究三维立体结构的规律，才能把握空间结构与功能之间的关系。目前虽然已经确切了解空间结构的蛋白质数据在600个以上，但还远远不能满足蛋白质空间结构研究和蛋白质结构与功能关系研究的基本需要。不过，从已知的这些数据中也已经可以总结出不少“一级结构－高级结构”、“结构一功能”之间的规律性。如已有实验获得了几种降钙素的类似物；合成模拟胰凝乳蛋白酶，一个具有分支四螺旋多肽结构，其酶的催化活性与天然蛋白质相比仅相差两个数量级；另外，人工合成钙选择性离子通道也有报道，这些都是类似蛋白质全新合成的产物。4．严格意义上的蛋白质工程在某种情况下，化学方法合成蛋白质或多肽也是方便可行的。特别是含有非肽成分的蛋白质的改造与构建，或非肽模拟构建新功能的蛋白质类似物时，化学方法更是必不可少。实际上许多蛋白质的活性中心结构中都包含有非肽的辅基成分，不管它们与肽链成分是否是共价连接，化学合成方法的应用都是必然的。另一方面，蛋白质和多肽的化学合成，无论是从合成的长度方面，还是从合成的精度方面，都有了很大的突破，并且已经拼接两个肽片段，使蛋白质的肽链合成摆脱了必须线性单向延长的单一模式，向多元化合成方式发展。在蛋白质工程领域中适时适当地结合应用各种生物学、化学、物理学的方法，无论是经典的还是现代的，定向设计还是随机筛选，单一的还是组合的，都完全可以开辟出一片新的天地。特别是蛋白质的全新设计和非肽模拟，可以按照人们的意愿创造出自然界中不存在的全新生物大分子。随着对蛋白质结构和功能的深入了解，蛋白质工程的发展速度必将越来越快，蛋白质分子设计也必将更加合理、更趋完善。这不仅会对生命科学领域产生深刻的影响，最终将彻底改变传统工业的高温、高压、高能耗的局面，使之成为节省能源，但却更为高效的生产方式。（二）蛋白质工程的主要研究方法1．蛋白质结构分析方法蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术。主要包括：蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程的计算机辅助设计与模拟研究等。2．分子生物学研究方法基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及遗传物质基因（DNA）的生物学理论与操作技术，它包括寡聚核苷酸片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱变、目的基因在载体系统中的高效表达等。三、蛋白质工程技术的发展历史蛋白质工程的研究和发展是与对蛋白质结构的深入了解密不可分的。1953年，英国的Sanger首先阐述了胰岛素的一级结构；其后不久，英国的Kendrew和Perutz成功地用X射线衍射测定了肌红蛋白和血红蛋白的晶体结构，为以后研究蛋白质一级结构、高级结构与生物活性之间的相互关系开创了先河。蛋白质晶体学属于X射线结晶学的一个新分支，即根据X射线衍射原理解析蛋白质中的原子在空间的位置与排列(立体结构)。自从20世纪50年代末首次用X射线晶体学方法测定了蛋白质——肌红蛋白的结构以来，已确定了二三百种蛋白质的三维结构，包括各种酶、激素、抗体、运载蛋白、毒素、肌肉蛋白、基因调控蛋白和膜蛋白等。80年代以来，由于基因工程技术能够让大肠杆菌大量产生人们感兴趣的蛋白质，科学家可以方便地对那些在机体内含量极微却又难以提取的蛋白质进行结构研究。三、蛋白质工程技术的发展历史另一方面，同步辐射、强X射线源及镭探测器的使用，使数据收集过程大大加速，从而使测定一个大分子结构所需的时间比过去大为缩短。例如，Bossman等人仅用了13个月的时间就完成了分子质量为800×104Da感冒病毒的结构测定，而Harrison完成第一个植物病毒的结构测定却花了整整十年的艰苦努力。近年来，随着蛋白质结构测定技术的改进和先进仪器设备的采用，已经积累了大量的有关蛋白质高级结构和一级结构的数据，使我们能够从中寻找出一些有关蛋白质折叠方式、结构以及与其功能性相关的规律，加之DNA测序技术的发展，大大加速了蛋白质工程工作的研究进展。四、蛋白质工程技术的展望蛋白质工程作为一种新型的强有力的研究手段，对一些基本生物学问题的研究和解决发挥了重要作用。从酪氨酸tRNA合成酶开始，该研究方法已经广泛地运用于研究各种蛋白质的结构与功能、蛋白质折叠和蛋白质分子设计等一系列分子生物学的基本问题。由于基因定位诱变的自如性，使研究工作突破了过去所用方法的局限，使有关研究达到前所未有的深度和广度。作为第二代遗传工程，蛋白质工程研究为当代生物技术的产业化发展注入了新的生命力。它已经在蛋白质药物改造、酶工程、抗体工程、分子电子器件和新型医学生物材料研制中获得越来越广泛的应用。蛋白质工程面临最大的挑战，也是最振奋人心的目标，是创造自然界中不存在的新型蛋白质。四、蛋白质工程技术