胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞

中国组织工程研究第20卷第36期2016–09–02出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember2,2016Vol.20,No.36ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5345·研究原著·文利红，女，1980年生，四川省仁寿县人，汉族，主要从事肿瘤方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)36-05345-06稿件接受：2016-06-04胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞文利红1，胡文杰1，叶恒曦2，向卫东3(1乐山职业技术学院，四川省乐山市614000；2乐山市中医医院肾病科，四川省乐山市614000；3西南医科大学附属医院(原泸州医学院附属医院)，四川省泸州市646000)引用本文：文利红，胡文杰，叶恒曦，向卫东.胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞[J].中国组织工程研究，2016，20(36):5345-5350.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.004ORCID:0000-0002-0113-628X(文利红)文章快速阅读：文题释义：侧群细胞：是利用Hoechst染料和流式细胞术进行造血干/祖细胞分离时发现的一群特殊细胞，广泛分布于多种成体组织、胚胎和某些肿瘤细胞系中；它既具有类似干细胞的自我更新和多向分化潜能，还具有独特的表型标记和生物学特征，代表了一种新的干细胞类型。对侧群细胞的研究，不仅有助于人们增加对干细胞增殖、分化及其发育调控机制的理解，同时还提供了一种从不同组织中分离纯化和利用多能干细胞的新策略，为组织工程和细胞治疗提供新的干细胞来源。树突状细胞与杀伤细胞：是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别病原、激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫反应的完成。树突状细胞和杀伤细胞两者在抗肿瘤细胞中有一定的互补作用，联合应用将取得“1+12”的疗效。树突状细胞-杀伤细胞免疫细胞疗法，就是在体外培养诱导其分化为树突状细胞，再用经抗原刺激的树突状细胞诱导杀伤细胞产生特异性肿瘤杀伤作用。摘要背景：目前临床常用的治疗手段难以彻底消灭肿瘤，其原因主要是由于肿瘤干细胞的存在。目的：探讨胃癌干细胞抗原负载树突细胞结合细胞因子诱导杀伤细胞对胃癌细胞的影响。方法：分离人胃癌细胞系侧群细胞，利用冻融法制备肿瘤抗原，将胃癌干细胞与树突细胞、树突细胞-杀伤细胞、胃癌细胞抗原、胃癌干细胞抗原进行联合培养，采用MTT检测胃癌细胞杀伤率，记录各组树突细胞表面成熟标志CD83表达率。结果与结论：①树突细胞组、树突细胞-杀伤细胞组、胃癌细胞抗原组的树突细胞表面成熟标志CD83表达率均显著低于胃癌干细胞抗原组，差异均有显著性意义(P0.05)；②树突细胞组、树突细胞-杀伤细胞组、胃癌细胞抗原组的胃癌细胞杀伤率均显著低于胃癌干细胞抗原组，差异均有显著性意义(P0.05)；③结果表明，以胃癌干细胞作为抗原刺激树突细胞，并结合细胞因子对杀伤细胞进行诱导，可以促进细胞增殖以及提高胃癌细胞的杀伤能力。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；胃癌；胃癌细胞；胃癌干细胞；抗原；杀伤细胞；树突细胞；细胞因子；诱导主题词：胃肿瘤；肿瘤干细胞；树突细胞；组织工程Tumor-killingeffectsofgastriccancerstemcellsasantigenstostimulatedendriticcellscombinedwithcytokine-inducedkillercellsWenLi-hong1,HuWen-jie1,YeHeng-xi2,XiangWei-dong3(1LeshanVocationalandTechnicalCollege,Leshan614000,SichuanProvince,China;2DepartmentofNephropathy,LeshanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Leshan614000,SichuanProvince,China;3AffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity(formerlyAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege),Luzhou646000,SichuanProvince,China)胃癌干细胞抗原负载树突细胞结合细胞因子诱导杀伤细胞对胃癌细胞的影响分离人胃癌侧群细胞，即胃癌干细胞，冻融法制备肿瘤抗原将胃癌干细胞负载树突细胞-结合细胞因子诱导杀伤细胞胃癌干细胞作为抗原刺激树突细胞，可增强树突细胞免疫表达，提高对胃癌细胞的杀伤作用文利红，等.胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞P.O.Box10002,Shenyang110180:Astheexistenceoftumorstemcells,itisdifficulttocompletelyeliminatetumorsinclinic.OBJECTIVE:Toexplorethetumor-killingeffectofgastriccancerstemcellsasantigentostimulatedendriticcellscombinedwithcytokine-inducedkillercells.METHODS:Sidepopulationcellsfromhumangastriccancercelllineswereisolated,andtumorantigenwaspreparedbyfreezethawingmethod.Aftercoculturewithdendriticcells,dendriticcellscombinedwithcytokine-inducedkillercells,gastriccancercellantigen,andgastriccancerstemcellantigen,killingratesofgastriccancercellsweredetectedusingMTTassay.ExpressionrateofCD83,amaturedendriticcellsurfacemarker,wasalsodetected.RESULTSANDCONCLUSION:TheCD83expressionlevelandkillingrateofgastriccancercellswerebothsignificantlylowerinthegastriccancerstemcellantigengroupthantheothergroups(bothP0.05).Theseresultsindicatethatgastriccancerstemcellsasantigentostimulatedendriticcellscombinedwithcytokine-inducedkillercellscanpromotetheproliferationofgastriccancercellsandelevatetheabilitytokillinggastriccancercells.Subjectheadings:StomachNeoplasms;NeoplasticStemCells;DendriticCells;TissueEngineeringCitethisarticle:WenLH,HuWJ,YeHX,XiangWD.Tumor-killingeffectsofgastriccancerstemcellsasantigenstostimulatedendriticcellscombinedwithcytokine-inducedkillercells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(36):5345-5350.0引言Introduction早期研究认为肿瘤组织中所有细胞的分裂增殖能力基本相同[1]。但是，Heimburgert等[2]对肿瘤细胞进行体外培养，仅有少数肿瘤细胞发生分裂克隆，其余的细胞则不具备分裂能力，这一研究结果表明，在肿瘤细胞中，仅有少数具有致瘤性，并由此提出肿瘤干细胞理论。之后，经过大量的研究也发现，肿瘤组织中的干细胞数量很少，但会对肿瘤的发生、发展、浸润及转移等起到决定性的作用[3-6]。肿瘤干细胞能够进行自我更新，且具有多向分化潜能，并表现出较强的不敏感性和耐药性等[7]。肿瘤干细胞理论的出现，为临床治疗各种肿瘤提供了新思路。胃癌是一种常见恶性肿瘤，发病率、病死率高，严重威胁到人体健康。临床常采用手术、放疗、化疗等多种方式治疗，但术后容易复发和转移，预后较差。为此，将肿瘤干细胞理论应用于胃癌相关研究之中，探讨胃癌的发病机制及有效治疗方法已成为重要课题。树突细胞是一种抗原递呈细胞，能高效摄取、加工处理以及呈递抗原等，从而激发免疫反应[8]。不同成熟度的树突细胞对机体生物免疫学功能的影响不同，其中未成熟树突细胞刺激T细胞增殖活化功能较弱，而成熟树突细胞能刺激T细胞增殖活化，诱导机体免疫应答，并在免疫应答的启动、调控以及维持等环节中发挥十分重要的作用[9]。负载胃癌干细胞作为抗原，让树突细胞对相应的肿瘤信息予以精确记忆并进行捕获，可以获得更好的肿瘤杀伤效果。为此，实验采用胃癌干细胞作为抗原刺激树突细胞，并结合细胞因子诱导杀伤细胞，分析其在杀伤胃癌细胞方面的效果。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外观察实验。1.2时间及地点于2015年5至6月在泸州医学院实验室完成。1.3材料胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞实验所用主要试剂和仪器：试剂及仪器来源重组人白细胞介素2北京双鹭药业股份有限公司重组人白细胞介素4广州市振康医药有限公司重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子华北制药金坦生物技术股份有限公司重组人干扰素γ上海东昕生物技术有限公司肿瘤坏死因子α武汉博士德生物工程有限公司抗CD3单抗上海丰寿生物科技有限公司DMEM培养基上海扶生实业有限公司5-氟尿嘧啶西安海欣制药有限公司四甲基唑蓝南京绿合生化技术有限公司Hoechst33342染色剂北京雷根生物技术有限公司胎牛血清天津百萤生物科技有限公司离心机江苏华大离心机股份有限公司水浴锅金坛市精达仪器制造有限公司低温冰箱浙江爱雪制冷电器有限公司文利红，等.胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5347人胃癌细胞系购自上海生博生物医药科技有限公司，人胃癌侧群细胞系由泸州医学院肿瘤实验室提供。1.4实验方法1.4.1分离人胃癌细胞系侧群细胞收集对数生长期的人胃癌细胞，用Hoechst33342染色并进行筛选，其中Hoechst33342弱阳性/阴性细胞为侧群细胞，Hoechst33342阳性细胞为非侧群细胞。将分选后的细胞以PBS进行重悬计数，用含青霉素、链霉素的DMEM培养基培养。1.4.2肿瘤抗原制备采用冻融法制备肿瘤抗原，收集对数生长期的胃癌细胞以及胃癌干细胞，置于无血清的DMEM培养基中培养，调整细胞浓度为1×109L-1，置于低温冰箱中冻存，然后置于水浴锅中孵育，重复操作5次，离心后收集上清备用。1.4.3树突细胞联合杀伤细胞(DC-CIK)培养获取健康孕妇脐血(均事先征得孕妇及其家属同意)，采用密度梯度离心法得到单核细胞，