组织工程支架材料XXXX0516 final

组织工程支架材料东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室黄宁平[e-mail]2011-5-16√组织工程支架材料√生物材料的表面工程支架设计与制备技术组织工程支架材料展望理想的组织工程支架应具备以下功能:1）良好的生物相容性使细胞可黏附和增殖，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2）可降解性及合适的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配；3）合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通的孔形态，以利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的长入；4）高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系，以利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子；5）与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；6）便于加工成理想的二维或三维结构，可以获得所需的组织或器官形状，易于重复制作，而且移植到体内后能保持原有形状。组织工程支架材料主要包括：（1）天然可降解高分子材料。如胶原（collagen），其本身就是天然骨的组织成分。壳聚糖（chitosan），是甲壳素的衍生物。还有明胶、琼脂、葡聚糖、透明质酸。降解产物易被机体吸收，但强度和加工性能较差，降解速度无法调节。（2）天然可降解无机材料。例如珊瑚是天然动物的骨骼，其中99％是磷酸钙。再如，珊瑚羟基磷灰石（CHA）。它们都具有天然珊瑚的多孔结构，有较好的孔隙率。能和靶细胞很好的黏附，而不影响增殖、分化、成骨。但加工困难。（3）合成可降解高分子材料。常用的可降解合成高分子材料有聚乳酸[poly（lacticacid）,PLA],聚乙醇酸[poly(glycolicacid),PGA],聚己内酯(polycaprolactam,PCL)等。这类材料的降解产物可在体内代谢排除，对机体无害，可塑性较好。（4）合成可降解无机材料。常用的主要有磷酸钙水泥(calciumphosphatecement,CPC)，羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP),生物活性陶瓷如生物活性玻璃陶瓷(biologicalactivityceramicglass,BCG),细胞外基质陶瓷类材料等。（5）复合材料。常用的有聚乳酸－羟基磷灰石生物材料表面对细胞的影响：生物材料表面能：表面能较高（较亲水）的表面更有利于细胞的黏附和铺展。生物材料表面的蛋白吸附能力：生理液体中含大量白蛋白和少量ECMs蛋白质（纤连蛋白FN、玻连蛋白VN和层连蛋白LN等）。生物材料表面电荷：在正电荷生物材料表面，细胞的黏附呈现连续性。生物材料表面的亲水－疏水平衡：疏水性表面对蛋白质的吸附能力较强。生物材料表面的拓扑（图案）结构：细胞根据材料表面的拓扑形貌而取向生长。生物材料表面的生物活性：生物材料表面具有整连蛋白认同的配体是细胞识别并接受生物材料为“自体”ECM的关键。组织工程研究现状组织工程研究的器官及其部分产品支架设计与制备技术1.天然高分子材料支架：蛋白质支架（胶原支架、明胶海绵、丝纤维基材）多糖支架（壳聚糖-阳离子多糖、海藻酸盐-存在于褐藻的阴离子线性多糖）蛋白质-多糖支架（明胶-海藻酸盐、壳聚糖－明胶）Preparationschemeofgelatinhydrogelsbythefreeze-dryingprocedure.冷冻干燥法制备明胶海绵支架示意图明胶海绵支架FabricationofporousgelatinscaffoldsH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344明胶水溶液用戊二醛交联形成凝胶，放置12h后用甘氨酸处理将水凝胶分别在－20°C和－80°C预冻12h（或在液氮中冷冻20min)冷冻干燥4天明胶是胶原的部分变性衍生物,由胶原的三重螺旋结构解体为单链分子而形成,可作为细胞培养的支架以及生长因子的控制释放载体。(a)Anopticalphotographofahydrogelfreeze-driedfollowingfreezingat-20℃and(b)aSEMmicrographofitshorizontalcross-section.SEMmicrographsofhorizontalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).-20℃,孔径250±120μm-196℃,孔径45±5μm-80℃,孔径85±35μmH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344SEMmicrographsofverticalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).迅速冷却时,冰晶将受到外应力的作用,而使它们在明胶水凝胶温度梯度方向上取向.不同冷冻温度条件下制备多孔支架的孔隙形态示意图随温度梯度的增大，支架内部孔隙呈三维，二维和一维结构。-20℃-80℃-196℃-80℃-196℃H.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344壳聚糖－明胶双层支架：人工皮肤支架皮肤为层状组织,真皮层由成纤维细胞及其细胞外基质构成,而表皮层中的表皮细胞所分泌的角蛋白纤丝不断从增殖层分化为角质层,以保护皮肤,防止水份流失及细菌的侵入.壳聚糖－明胶双层支架：人工皮肤支架壳聚糖与明胶经戊二醛共交联形成杂混聚合物网络(HPN)凝胶,将此溶胀水凝胶经冷冻干燥可制备多孔支架.将装有水凝胶的培养皿直接放在-56˚C的冷却板上,通过调整热传导方式梯度控制样品的预冻过程.此时溶胀水凝胶底部直接与冷却板接触,是直接热传导过程;上部是与空气的对流热传导过程,属于间接热传导过程.由于热传导速率的不同,将形成双层支架,其底层为致密层(孔径较小),上部为疏松层,可用作人工皮肤支架，其透氧性优异，能控制蒸发水的损失量，防止外源性微生物的侵入。Thelamellarstructureofthebilayerscaffoldwithdifferentlocalmagnification:(a)100;(b)400;(c)1000:壳聚糖－明胶双层支架的层状结构,致密表层的孔径为0.43μm,疏松底层平均孔径102μm.J.S.Maoetal.Biomaterials24(2003)1067–1074Keratinocytesculturedfor1weekonfibroblast－containingscaffoldsthathadbeenculturedfor3weeks:(a)H&E;originalmagnification×100;and(b)H&E;originalmagnification×400.角质形成细胞在成纤维细胞培养3周的支架上培养1周后的HE（苏木素－伊红）染色照片J.S.Maoetal.JBiomedMaterRes64A(2003)301–308纤维粘结技术Fabricationofnon-woven相分离技术phaseseparation溶剂流延－颗粒沥滤法Solventcastingandparticularleaching（成孔剂析出法）膜材层压法Membranelamination熔融模塑法Meltmoulding超临界流体技术Supercritical-fluidtechnology（高压处理法、气体发泡法）2.合成降解聚合物支架制备技术溶剂流延－颗粒沥滤Solventcastingandparticularleaching将盐粒(用标准筛筛分)分散于PLLA的二氯甲烷溶液中，使之在玻璃培养皿中成膜。待溶剂挥发后真空干燥，将膜浸入水中，洗去NaCl，即得到多孔膜。通过热处理(退火或淬火)可以调节PLLA膜的结晶度（半结晶或非晶态），调节盐粒大小和用量可控制孔的尺寸及孔隙率.缺点是孔隙贯穿率低，必须使用有机溶剂，阻碍了水溶性生物活性剂与支架材料的结合。SEMof90%porous75:25PLGAfoamsfabricatedbyasolvent-castingparticulate-leachingtechnique.Thefoamsexhibitedporesizesrangingfrom150–300μm(a),300–500μm(b),and500–710μm(c).Atopviewofapolymerfoampreparedwithsaltparticlesrangingfrom300–500μmandseededwithcells(22.1×105cells/cm2)revealslayersofosteoblastscoveringtheporessurfacesafter1dayinculture(d).IshaugSL,JournalofBiomedicalMaterialsResearch,Vol.36,17–28(1997)植入物孔径为20μm时适于成纤维细胞的长入，20～125μm时适合成年哺乳类皮肤组织的长入，而100～250μm适合骨组织再生。采用溶剂流延/盐颗粒沥滤技术可制备87％～91％孔隙率、孔径100～500μm的多孔支架。采用乳液冷冻干燥法可得到孔隙率90％、孔径20～200μm的支架。相分离法/冷冻干燥法Phaseseparation/freezedrying用于制备组织工程多孔支架的相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法，按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。该法避免了高温，有利于生物活性分子如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放。乳液冷冻干燥将水与聚合物溶液一起均化得到油包水乳液，并浇铸到模具中，冷冻干燥脱除水分和溶剂，得到多孔支架。支架孔隙率91-95％，平均孔径13-35μm,大孔尺寸达200μm，孔表面积达58-102m2/g，为相连的孔结构。MC:二氯甲烷PolymerVol36,1995,837-842SEMsofPLGAscaffoldsusedininvitroproteinrelease.(a)Group1:poresize=58±2μm.(b)Group2:poresize=33±8μm.(c)Group3:poresize=65±5μm.Allscaffoldshadabout90%porosityandabout10m2/gspecificsurfacearea.PolymerVol36,1995,837-842改变参数（如水体积分数，聚合物质量分数以及聚合物分子量）可调控支架的孔隙率，平均孔径及比表面积。3.快速成型（Rapidprototyping,RP)又称固态自由成型（Solidfreeform,SFF)虽然传统的支架制造方法应用已经十分广泛，但存在致命的缺点，主要表现为制造过程人工操作、使用有毒的有机溶剂，很难制造出与缺损组织相匹配的外形轮廓。使用快速成型技术（RP）或固态自由成型制备（SFF）方法来制造组织工程支架，不但可避免上述缺点，而且还可有效结合CAD技术，实现对支架结构的优化与仿生设计，以及对支架制造过程的精确控制，可以设计出宏观构造与缺损组织几乎完全相同的3D结构物，可以形成完全通孔、高度规则、形态与微结构具有重复性的支架.快速成型术（RP）制备骨支架，CT扫描患者缺损骨的数据信息。（a）形成计算机三维模型；（b）把模型引入RP软件系统，将其按指