色谱分析在物质分离中的应用-毕业论文

陕西科技大学（论文）I生物工业下游技术课程论文Thebiotechnologyindustrydownstreamtechnologycoursework色谱分析在物质分离中的应用专业名称：生物化工工艺班级：092班姓名:王黎明学号：20090305248指导教师：田颖陕西科技大学（论文）I色谱分析在物质分离中的应用摘要色谱法（chromatography）是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术，色谱分析技术已成为药物分析学科领域中最基本也是最重要的研究手段和方法，具有广阔的应用前景。海洋真菌及其代谢产物中的某种化学成分是天然药物和天然食品添加剂的重要来源。由于某些有效的成分往往含量较低，并与许多其他化学成分并存，其提取分离是一项繁琐而艰巨的工作。色谱技术的发展与应用，对于各类有机物化学成分的分离、纯化与鉴定工作起着重大的推动作用。本论文实验主要是针对一株海洋真菌的四种培养条件（H1、PDB、GMPY和大米培养基）进行优化，其菌丝体和菌液经乙酸乙酯萃取获得粗样后再进行初步的柱色谱分离与纯化，配以TLC､HPLC/UV检测，以期获得含有目标化合物的培养条件。筛选结果表明：H1培养基和大米培养基的代谢产物丰富，适宜进一步研究。关键词：柱色谱，薄板层析，高效液相色谱/紫外分析技术，海洋真菌，培养条件优化陕西科技大学（论文）IIABSTRACTChromatographyisahighlyefficientseparationtechnologywhichisusedtoisolatemulti-componentorganicmixture.Chromatographytechnologyhasbecomeoneofthemostimportantandfundamentalresearchtoolsandmethodsindruganalysisarea.Ithasbroadapplicationprospects.Thechemicalcompositionsofmarinefungusandtheirmetabolitesisanimportantsourceofsomenaturalmedicineandnaturalfoodadditives.Becauseofthelowcontentsofsomeactiveingredientsandco-existencewithmanyotherchemicalelements,theirextractionandisolationisatediousanddifficulttask.Developmentandapplicationofchromatographictechniqueisplayingasignificantroleinpromotingtheseparation,purificationandidentificationofvariousorganicchemicalcomponents.Experimentofthethesisfocusesontheoptimizationoffourcultureconditions(H1,PDB,GMPYandRICE)ofthemarinefungus.Themyceliumandbrothsamples,extractedbyethylacetateinadvance,conductapreliminarycolumnchromatographyisolationandpurification,togetherwiththeTLC､HPLC/UVdetection,inordertoobtainthecultureconditionsofcontainingthetargetcompounds.Theseresultsdemonstratethat:H1mediumandRICEmediumwithrichmetabolitesandcontainingsomeofthetargetcompoundsaresuitableforfurtherstudy.KEYWORDS:Columnchromatography,TLC,HPLC/UVanalysistechniques,marinefungus,optimizationofcultureconditions陕西科技大学（论文）III前言本次研究课题的目的在于色谱分析在海洋真菌活性成分筛选中的应用情况。海洋活性真菌的次级代谢产物种类丰富，过去研究的焦点主要在海藻和软体动物身上，并且得到了许多极具潜力的药物先导化合物。近年来大量的生物学及生态学的研究结果表明，从海绵动物中得到的许多化合物，其初始来源是与宿主有机体共生的海洋微生物。目前，海洋药物可持续性研究已经逐步转向关注与宿主动物共生的微生物。海洋动植物资源有限，收集困难，分离纯化复杂，难以工业化生产等弊端一直是阻碍海洋药物研究进一步开展的棘手问题，而海洋中种类最为多样的海洋微生物以其代谢产物多样和可培养性逐渐引起了研究者的关注，尤其在抗肿瘤活性方面，利用这些丰富的海洋天然产物，经有机全合成或适当的化学结构修饰等手段可用来生产高活性的海洋药物。海洋药物在临床或临床前研究中表现出乐观的前景，而该领域的发展促使这些海洋生物的获取方法不断更新。色谱技术是分析化学领域最重要的分离分析手段。随着色谱研究工作的迅猛发展，各种新的色谱方法和检测技术日趋成熟，色谱联用技术也随之应运而生，因其具有高速、高效、高分辨、微量检测及分析自动化的性能和技术优势，而显示出广阔的应用前景。近年来，色谱联用技术在药物及其代谢产物研究、天然药物化学成分分析及生物大分子分析等方面的应用较为广泛。高效液相色谱是天然产物化学研究中的一种常规分析技术，已被广泛应用于天然产物的分析、分离包括制备性分离、纯化，以及检测化合物的纯度等多方面。目前国外很多实验室都有液相-紫外-二级管阵列检测（LC/UV-DAD）联用仪。LC/UV-DAD技术的适用对象是具有强发色团的天然产物,通过分析可获得非常有用的在线结构信息。目前最新的LC/UV-DAD联用仪不仅可以测定每个流出峰的紫外光谱，LC/UV-DAD图谱进行分析时有一点需要注意，由于化合物的紫外光谱与使用的溶剂系统的组成有关，因此同一化合物在不同溶剂系统中测定的紫外光谱会有一些差别。本论文实验主要是针对一株海洋真菌的培养条件进行优化，然后进行初步的柱色谱分离与纯化，配以TLC､HPLC/UV检测，渴望得到含有目标化合物的培养条件，为后续的专性研究提供有利的基础保障，并在论文过程中体会科研的基本过程，培养基本的科研素质。陕西科技大学（论文）IV第1章综述1.1色谱分析简介1.1.1色谱法概况色谱法（chromatography）又称色层法、层析法，是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术。1906年，俄国植物学家茨维特（tsvet,1872-1919）首创了这种分离技术，他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带（即植物色素的分离），且以不同速度过柱子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。当时，茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法。七十多年来，色谱理论逐步建立和发展，色谱分离技术已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手段，色谱方法的应用范围不断扩大，色谱分离的对象早已不限于有色物质，但“色谱法”这一名称一直被沿用[1]。图1-1色谱分析的一般原理示意图色谱法是基于混合物各个组分在两相（固定相和流动相）之间的不均匀分配进行分离的一种方法。不均匀分配的先决条件，是各个组分对两相亲和力的不同和向两相不均匀分配的可能性。由于混合物中各组分对两相的亲和力有差异，它们穿过固定相的流动速度（或在固定相中的滞留时间）就不同，从而得到分离。色谱法的基本原理可用图1-1来描述。图中，SP和MP分别表示毛细管色谱中的固定相和流动相；S1和S2是待分离的两种组分物质，被分离混合物组分S1对流S1S1ˊS2S2ˊSPSPMPMP陕西科技大学（论文）V动相具有较高的亲和力，而组分S2更亲固定相；S1和S2代表两组分按箭头所指方向随流动相流过管子一定时间后所到达的区域位置。图1-2用圆球形物质和浸入固定相SP和流动相MP中的程度，表示混合物组分在两相之间分配的差异。由于热运动的缘故，被分离物质中的分子具有连续进入两相中的趋势。然而，它们在固定相中的平均滞留时间（即在该动力学过程中使物质得以分离的时间）有不同，物质S1的分子主要处于流动相中，它们被流动相带走的量按计算比平均数多，而S2在固定相中的平均滞留时间比S1长。一定时间后，S1的色谱带就会展现在S2的色谱带之前。因此，用色谱法就会实现S1和S2的组分分离。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。色谱法的分离方法，按产生分离过程的相系统来分有柱色谱法（columnchromatography,CC,在柱子中进行）、纸色谱法（paperchromatography,PC,在纸上进行）、薄层色谱法（thinlayerchromatography,TLC,在薄板或薄膜上进行）、毛细管色谱法（capillarytubechromatography,CTC,在毛细管中行）。按流动相分类的现代色谱法有气相色谱法、高效液相色谱法。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，均系指在室温下操作。分离后各成分的检出，通常采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在陕西科技大学（论文）VI245-365nm的紫外灯下检测。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检测。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测[2]。色谱技术在研究天然有机化合物中有着广泛应用。动物、植物、微生物及其代谢产物中的某种化学成分是天然药物和天然食品添加剂的重要来源。由于有些有用的成分往往含量较低，并与许多其他化学成分并存，其提取分离是一项非常繁琐而艰巨的工作。溶剂提取分离技术是天然产物提取分离的经典技术，但溶剂耗量大，分离效率低，环境污染严重，操作安全性差，因此一般仅用于实验室小量样品的制备，而不适用于大批量的工业生产。无论是天然药用植物或动物，在我国有着种类多、分布广的优势。对它们的组分结构与生理活性关系的研究以及对天然物质的综合利用是当今极具潜力的研究课题，并要求对自然资源的研究与开发向深入化、快速化、微量化方向发展，以获取安全无毒高效的天然有效成分服务于人类，色谱技术正符合这种要求，并在以下几个方面得到广泛应用。（1）分离混合物在天然物提取的有效部位中，往往含有结构相似、理化性质相近的