细胞工程技术选育的草地早熟禾新种质的耐热性分析

书书书细胞工程技术选育的草地早熟禾新种质的耐热性分析王婷婷，徐国荣，张举仁，杨爱芳（山东大学生命科学学院，山东济南２５０１００）摘要：通过对离体培养的草地早熟禾丛生芽块进行高温处理，筛选出一批耐热性好的小芽。小芽成苗后移栽到花盆在自然条件下生长。半年后对这些株系和原品种的植株进行热胁迫处理，同时测定叶绿素荧光、丙二醛含量、离子渗漏率、叶绿素含量等生理指标的变化，得出细胞工程株系的植株耐热性明显较高，热胁迫处理后损伤程度小于原品种植株。表明利用细胞工程技术能有效获得耐热性显著提高的草地早熟禾植株，为选育草地早熟禾耐热新种质提供材料。关键词：草地早熟禾；细胞工程；耐热性；生理指标中图分类号：Ｑ９４３；Ｓ５４１＋．９０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０２００６００６　草地早熟禾（犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊）是一种优良的冷季型草坪草，是温带地区重要的草坪草种之一。它具有多种优良特性，常用于草坪和绿地的建植。但草地早熟禾耐热能力差，在盛夏季节生长停止，甚至部分死亡［１］。若使草地早熟禾品种获得良好的耐热性，不仅能在盛夏维持草坪绿色，而且可在夏季炎热地区被广泛利用，具有重要的经济效益和环境效益。有关草地早熟禾育种研究的报道相对较少，主要采用筛选自然突变体［２，３］或传统杂交［４，５］等方法培育新品种。由于草地早熟禾兼性无融合生殖方式［６］，传统育种方法的利用受到很大的制约。随着细胞工程技术的发展，将传统育种与细胞工程技术结合，利用体细胞无性系变异，进行突变体筛选，可以获得抗逆性增强的新品种。１９９７年，Ｍｏｏｎ和Ｏｔｔｏｂｏｎｉ［７］将玉米（犣犲犪犿犪狔狊）愈伤组织培养在含有铝离子的培养基上，直接筛选出了耐铝的突变体。１９９８年，张举仁和高树芳［８］利用玉米愈伤组织为材料，筛选出了对小叶斑病毒素具有抗性的愈伤组织并再生植株。２００７年，宋玲玲［９］在加ＮａＣｌ培养基上连续３代筛选离体培养的高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犲犾犪狋犪）丛生芽芽块，获得了耐盐耐旱性明显提高的株系。温度对植物的生长发育有着重要的影响［１０］。植物在高温下的生理生化变化是反应植物耐热性的重要指标［１１～１３］。在对冷季型草坪草高温条件下生理指标的测定中发现，叶绿素相对含量下降慢、细胞质膜透性和ＭＤＡ含量低的品种其耐热性要好［１４，１５］。热胁迫下，草地早熟禾不同品种的生长发育均受到不同程度的影响，表现为生长减缓、叶色变浅、伤害表现明显［１６］。另外，高温条件下，不同的光照条件对牧草的性状也有着重要的影响［１７］。本研究以利用细胞工程技术获得的耐热性有一定提高的草地早熟禾株系为材料进行耐热性分析，确定这些株系的耐热性与原品种相比是否有显著提高和它们的利用价值。１　材料与方法１．１　材料所用的草地早熟禾品种为纳苏（Ｎａｓｓａｕ）和Ｍａｒｄｏｎａ。草地早熟禾无菌种子苗待胚轴伸长至２～５ｃｍ时，切取约５ｍｍ左右的上胚轴和茎尖部位，接种到诱导培养基（ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋３０ｇ／Ｌ蔗糖）上培养１５～２０ｄ。待切段基６０－６５２００９年４月　　　草　业　学　报　　　　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　第１８卷　第２期Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２收稿日期：２００８０７１０；改回日期：２００８１０１６基金项目：国家高技术研究发展（８６３）计划项目（２００７ＡＡ０９１７０１）资助。作者简介：王婷婷（１９８３），女，陕西兴平人，硕士研究生。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]部膨大后，将上面多余部分切去并剥离包裹在基部膨大部位的叶鞘，取基部约５ｍｍ切段转移到丛生芽继代培养基（ＭＳ＋３．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋３０ｇ／Ｌ蔗糖）上培养１５～２０ｄ，逐渐有许多小芽从基部生出形成丛生芽。将培养１５～２０ｄ后形成的丛生芽块剥去基部较老的叶鞘，切成３～４个小芽为单位的小芽块转移到新的继代培养基上继续培养，每１５～２０ｄ继代１次，小芽不断扩增［１８］。将继代培育半年的草地早熟禾丛生芽块切成大小一致的小块，在４９℃高温下处理１ｈ，然后放回正常生长条件下（２５／２０℃光／暗，光照１６ｈ／ｄ，光强２０００ｌｘ）恢复培育２ｄ，再在４９℃下高温下处理１ｈ，然后恢复培养。在恢复培养２周后将存活小芽中萎蔫程度轻、生长状态较好的小芽选出，生根后移栽至花盆。生长半年后，分株移栽到纸杯，放于人工气候室中（２３／１８℃光／暗，光照１６ｈ／ｄ，光强１２０００ｌｘ）培养３０ｄ，选择生长状态基本一致的植株进行耐热性分析。耐热性分析所用株系有：１）Ｍ２６、Ｍ９７、Ｍ２５和Ｍ９７，为耐热性筛选产生的Ｍａｒｄｏｎａ细胞工程株系，ＭＣＫ为Ｍａｒｄｏｎａ对照；２）Ｎ１、Ｎ５、Ｎ６３和Ｎ２１，为耐热性筛选产生的纳苏细胞工程株系，ＮＣＫ为纳苏对照。１．２　草地早熟禾植株热胁迫处理条件人工气候室中培养的草地早熟禾按照下列温度变化在光照培养箱中进行热处理。２３℃→３８℃（２ｈ）→４０℃（２ｈ）→４２℃（２ｈ）→４４℃（２ｈ）→４６℃（５ｈ）→２３℃（７ｄ）。分别于处理前、处理结束后２和７ｄ时照相。其中部分材料热处理结束后将叶片全部剪去，观察生长情况，生长１０ｄ后照相。１．３　叶绿素荧光的测定图１　热胁迫处理前后草地早熟禾的生长状态犉犻犵．１　犌狉狅狑狋犺狊狋犪狋狌狊狅犳犘．狆狉犪狋犲狀狊犻狊犫犲犳狅狉犲犪狀犱犪犳狋犲狉犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊Ａ：处理前；Ｂ：２３℃恢复生长２ｄ；Ｃ：２３℃恢复生长７ｄ；Ｄ：热胁迫处理后剪去叶片在２３℃恢复生长１０ｄＡ：ｐｌａｎｔｓｂｅｆｏｒｅｓｔｒｅｓｓ；Ｂ：ｐｌａｎｔｓｒｅｖｉｖｅｄｆｏｒ２ｄａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；Ｃ：ｐｌａｎｔｓｒｅｖｉｖｅｄｆｏｒ７ｄａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；Ｄ：ｐｌａｎｔｓｈａｄｃｕｔｏｆｆｌｅａｖｅｓｆｏｒ１０ｄａｎｄｇｒｅｗａｔ２３℃ａｆｔｅｒｓｔｒｅｓｓ用便携式荧光测定仪（ｍｉｎｉＰＡＭ）在热激处理前、３８，４０，４２，４４和４６℃处理完成时及２３℃恢复培养１２和２４ｈ时分别测定草地早熟禾叶片叶绿素荧光。测定前暗适应３０ｍｉｎ。１．４　丙二醛、离子渗漏率和叶绿素含量的测定分别在热处理前、４６℃处理完成、２３℃恢复２和７ｄ后４个时间点上取草地早熟禾叶片测定丙二醛含量、离子渗漏率和叶绿素含量。丙二醛含量根据赵世杰等［１９］方法进行测定，叶片离子渗漏率和叶绿素含量按照王晶英等［２０］方法进行测定。１．４．１　丙二醛含量的测定　取不同胁迫时间的叶片，加５ｍＬ提取液（１０％三氯乙酸）研磨离心，取上清液２ｍＬ，加入０．６％硫代巴比妥酸２ｍＬ（内含１０％三氯乙酸），摇匀，于沸水浴中煮沸１５ｍｉｎ，立即放于冰上冷却，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液测定５３２，６００和４５０ｎｍ波长下的吸光度值。１．４．２　离子渗漏率的测定　取下叶片用蒸馏水洗净、擦干，将叶片置于２５ｍＬ双蒸水中在真空干燥器中于０．５×１０５Ｐａ负压下抽气１０ｍｉｎ，然后于室温振荡２ｈ，再将样品煮沸１５ｍｉｎ，期间加水以避免蒸干，冷却至室温后定容至２５ｍＬ测定电导率。１．４．３　叶绿素含量的测定　取胁迫处理的植株叶片，剪碎后放于离心管中，８０％丙酮浸泡，避光放置，直到叶片发白后将叶绿素丙酮提取液倒入比色杯中１６第１８卷第２期草业学报２００９年用分光光度计分别在波长６６３和６４５ｎｍ下测定吸光度值。１．５　数据处理与统计学分析叶绿素荧光测定设５个重复，丙二醛含量、离子渗漏率和叶绿素含量测定均设３个重复，所得数据用Ｅｘｃｅｌ和ＳｉｇｍａＰｌｏｔ９．０进行统计分析。细胞工程植株与同条件下的原品种植株（野生型对照）相比较，犘＜０．０５和犘＜０．０１为差异显著（表示）和极显著（表示）。２　结果与分析２．１　热胁迫对草地早熟禾表型的影响胁迫处理前植株叶片鲜绿、挺拔，热胁迫处理完成时植株虽轻度萎蔫，但株系间差异不明显。２３℃恢复２ｄ后，植株叶片萎蔫下垂，叶尖干枯，受损严重，细胞工程植株明显较好。２３℃恢复生长７ｄ时，各株系植株与胁迫后２ｄ时相比萎蔫程度明显减轻，对照植株与经耐热性筛选的工程植株差异明显，对照植株恢复正常生长所需时间较长（图１）。在恢复生长１０ｄ后，对照株系的生长状态明显差于各细胞工程株系的（图１Ｄ），细胞工程株系在受胁迫后恢复快，１周后生长速率恢复到处理前水平。２．２　热胁迫对早熟禾叶片叶绿素荧光的影响叶绿素荧光最大量子产量犉狏／犉犿（光化学效率）反映了ＰＳⅡ的最大光能转化效率。随着胁迫温度的升高，草地早熟禾叶片的犉狏／犉犿值逐步下降（图２）。来自Ｍａｒｄｏｎａ的各个株系的下降程度低于对照Ｍａｒｄｏｎａ，即细胞工程植株叶片的ＰＳⅡ损伤程度较轻。来自纳苏的各株系除Ｎ２１外，其犉狏／犉犿值的下降程度也小于对照纳苏。将热胁迫处理后的植株转入２３℃下恢复生长，犉狏／犉犿在初期仍继续下降，然后逐步回升，但恢复速率不同。来自Ｍａｒｄｏｎａ的各细胞工程株系和除Ｎ２１外的来自纳苏的各细胞工程株系的犉狏／犉犿值在２３℃恢复２４ｈ时基本回到胁迫处理前水平，而对照植株恢复慢，２３℃恢复２４ｈ仍明显低于胁迫处理前。２．３　丙二醛含量的变化热激胁迫前，各株系间ＭＤＡ含量差异不明显，均在１１ｎｍｏｌ／ｇＦＷ左右。在４６℃处理５ｈ，不同株系的ＭＤＡ含量均有上升，但上升幅度有差异。在胁迫恢复前期，ＭＤＡ含量继续上升，且对照植株比其细胞工程植株上升速度快。其中来自Ｍｏｒｄｏｎａ的３个细胞工程株系在２３℃恢复２ｄ时，ＭＤＡ含量均与Ｍｏｒｄｏｎａ差异显著，来自纳苏的Ｎ５和Ｎ１株系与纳苏相比ＭＤＡ含量也差异显著，即对照植株ＭＤＡ含量最高。在恢复处理７ｄ时，各株系的ＭＤＡ含量已停止上升或下降，说明细胞受损状态已部分恢复（图３），此时Ｍ２５和Ｎ６３等的ＭＤＡ含量与对照之间仍存在显著差异，这些株系热胁迫处理后恢复速度较快。２．４　离子渗漏率的变化离子渗漏率是反应细胞膜受损程度的一个重要的指标。在热胁迫处理前，对照和细胞工程植株叶片的离子渗漏率差异不明显，均在４％左右。４６℃处理５ｈ，多数株系的离子渗漏率上升，其中对照植株上升幅度最大。热胁迫后的恢复早期，叶片离子渗漏率继续上升，各株系间出现显著差异。与对照植株相比，多数细胞工程株系的植株细胞膜受损程度小。随着恢复时间的延长，各株系的离子渗漏率都有所下降（图４），细胞膜受损程度得到明显恢复。２．５　叶绿素含量的变化环境胁迫可引起叶绿素合成受阻，降解加快，造成叶绿素含量下降。叶绿素含量对热胁迫的响应速度比较慢。结果显示（图５），４６℃热处理５ｈ，不同株系的叶绿素含量无明显变化。在胁迫处理后的恢复早期，叶绿素含量出现下降，但Ｍ２６和Ｍ９７变化不大，而对照Ｍｏｒｄｏｎａ和Ｍ２５则下降明显。在恢复生长后期，除对照外的各株系的叶绿素含量都有增加，与对照相比达到差异显著水平。并且由于取样时新生叶片比例高导致叶绿素含量高于胁迫处理前的（图５）。２．６　耐热植株后代的表现经历耐热性试验的植株在恢复生长后，于次年春天开花结种。各株系均自然开花授粉，种子发育正常。其中Ｍ２７和Ｍ９７的开花时间明显早于对照Ｍａｄｏｒｎａ，提前２０ｄ左右（图６）。有可能热胁迫对野生型植株造成较大损２６ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２伤，以致在恢复期生长较慢，开花时间推迟；也可能是耐热筛选时，产生了开花提前的突变体。不同的细胞工程株系和对照相比，叶色和叶片性状在适宜温度条件下均无明显差异，但耐热性明显提高。３　讨论作为一种冷季型草坪草，草地早熟禾最适的生长温度地上部为１５～２４℃，根系为１０～１８℃。这一特性使得草地早熟禾在炎热地区难以越夏，大大制约了其应用。目前，对于草地早熟禾的耐热性的提高仅仅局限于利用适当的水、肥、修剪等管理措施来提高其耐热性，有关利用生物工程的方法提高其耐热性未见报道。本研究利用生图２　热胁迫对草地早熟禾叶片犉狏／犉犿的影响犉犻犵