细胞工程（一）

基因工程部分复习一、基因及基因工程概述二、基因工程理论基础三、基因工程工具酶四、基因工程载体五、目的基因的获得六、目的基因与载体DNA的连接七、目的基因导入受体细胞八、重组体筛选与鉴定九、目的基因的高效表达十、基因工程的应用及发展前景举例：干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性。早期的干扰素是用病毒诱导人体白血球或白细胞产生的，其产量低、价格昂贵。现在可以利用基因工程生产干扰素。细胞工程（一）一、细胞工程概述（一）细胞工程的定义（二）细胞工程分类和研究对象（三）细胞的主要培养技术（一）细胞工程的定义细胞工程是在细胞水平上的工程，它应用细胞生物学和分子生物学的方法，以细胞和细胞器为对象进行操作，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为的使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，最终获得人们所需要的组织、细胞或个体。（P51）（二）细胞工程分类和研究对象A、根据研究对象划分动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程B、根据研究水平来划分组织水平细胞水平细胞器水平基因水平C、根据实验操作对象可分为：细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体操作转基因生物等（三）细胞的主要培养技术1、无菌操作技术2、细胞培养技术：指生物细胞和组织在体外无菌条件下和适当的温度、气体和营养环境中的保存、生长和增殖。是细胞工程的最基本技术。3、细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合为一个杂合细胞的技术。包括病毒融合、化学融合、和电融合4、细胞核移植技术：利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。教材：P53～56二、动物细胞工程（一）、动物细胞研究历史进展和应用（二）、哺乳动物细胞培养（三）、动物细胞融合和单细胞克隆等技术简介（一）动物细胞研究历史进展和应用1、动物细胞工程发展历史1）、细胞融合现象的发现19世纪30年代到50年代，Muller等相继在肺结核、天花等病理组织中和正常组织中（如骨髓和肺等）观察到多核细胞现象；到1959年，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被接受。2）、动物细胞培养技术的建立1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914年，Thomson建立了器官培养技术。1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。3）、细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生1958年,Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。4）、动物克隆技术的建立1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：①证明了动物细胞仍然具有全能性；②初步建立了体细胞核移植的实验体系，③卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用2、动物细胞工程的应用动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体）新品种培育试管动物与婴儿组织工程珍稀动植物资源的保存与保护（二）、哺乳动物细胞培养1、培养对象细胞和性质培养对象：哺乳动物细胞和昆虫动物细胞哺乳动物细胞种类与性质根据细胞的寿命，分为非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以指数式形式增加，当细胞密度达到一定程度时，细胞停止分裂，不再生长。但当被放到新鲜培养基中，细胞重新生长。这样可以连续传代。这种细胞包括癌细胞、表皮细胞和成纤维细胞。致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传代，往往分裂几代或几十代后就会死亡。大多数细胞属于这类细胞。2、培养过程1）动物细胞分离和传代培养过程A获得原代细胞原代培养：从特定功能组织器官中分离后，无法增殖或处于稳定传代培养前动物细胞，又叫初代细胞。获得原代细胞是一系列细胞培养的第一步获得原代细胞的步骤：解剖分离培养液淋洗和切成碎片再淋洗酶法分离成单个细胞离心分离后再培养B连续化培养大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。一般情况下，非致死细胞可直接转化为连续细胞，可以连续增殖；而其他细胞需要经过环境适应（如啮齿动物细胞）、杂交或基因修饰才能转化为连续细胞。细胞系：经过原代培养，细胞逐渐形成具有相似生理即代谢特性的稳定细胞系，可供繁殖和多次传代培养。一旦原代细胞进行了传代培养即成为细胞系。细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株具有特殊的表型性质。2）动物细胞培养的环境特性A生物特性具有精细分工、职能专一的细胞器能够进行蛋白质翻译后的修饰。B营养要求开始的培养基主要是全血清培养基，但由于血清的缺陷，目前开发无血清培养基是细胞培养的主要方向。3动物细胞培养方法动物细胞的离体培养方法有两种方式：1）贴壁培养：贴附在比表面积较大的微载体上或直接贴附在反应器器壁上，A对象：大多数原代细胞Ｂ贴壁基质要求：要求是单层膜和正电荷；通常是用玻璃或一次性塑料C实验室培养：多空板培养皿和培养瓶等小容器比表面积：单位质量物质的表面积（㎡/g）2）悬浮培养：直接培养于培养基中，不需要任何贴附表面，可在同期搅拌罐中培养。A培养对象：极少数原代细胞适合悬浮培养，仅有造血细胞系、啮齿类的腹水和小细胞肺癌。而大规模的动物细胞培养往往是从适应悬浮培养开始的。B培养方式：实验室：采用小摇瓶和小转瓶形式工业化生产（大规模培养）：通气搅拌罐（四）、动物细胞融合和单细胞克隆等技术简介1细胞融合技术1）、定义细胞融合：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象2）分类同源融合细胞：基因型相同的细胞形成的融合细胞。异源融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞。教材：P61～683）、技术过程①原生质体制备:主要针对植物细胞和微生物细胞②诱导细胞融合：可以通过三种途径诱导两种细胞融合在一起。③筛选、克隆杂合细胞：通过选择性培养基，使得杂合细胞生长而非融合细胞不能生长，并进一步筛选和克隆杂合细胞，从而获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。4）细胞融合途径①灭活病毒诱导：融合率较低，重复性不够高②化学诱导融合：用聚乙二醇（PEG）介导③电融合：将悬浮细胞在低压交流电场（100～200v/cm）中聚集成串珠状细胞群，或将培养细胞形成单层接触，然后加高压电脉冲（1～1.8kv/cm,脉冲宽0～100μs），导致胞间细胞质沟通，造成细胞融合。其优点有：效率高；杂交频率高，为PEG法的100倍；操作方便，对细胞无毒害作用；可在显微镜下操作2单克隆抗体技术当抗原，即某些外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质）等进入动物或人体后，会刺激后者形成相应的抗体，抗原与抗体之间是特异结合的，所以抗体种类有百万种之多。抗体一般是有Ｂ淋巴细胞分泌，每一种B淋巴细胞分泌一种针对性的抗体，显然如果需要从某一种专一抗体，需要首先从某个特定的B淋巴细胞培养大量细胞克隆，然后体外培养。而B淋巴细胞不能无限繁殖。需要新的技术1975年，Milstein和Kohler利用肿瘤细胞无限增殖的分生的特征，将B细胞与之融合,获得了既能产生单一抗体又能体外无限生长的杂合细胞。1984年，二人获得诺贝尔生理学与医学奖。单克隆技术也可用来构建连续细胞三、转基因动物转基因动物：是人类按照自己的意愿，借助基因工程技术将外源基因导入受体动物细胞染色体内，有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，使得外源基因与受体细胞整合、在体内稳定表达并能稳定遗传给后代的动物。教材：P57～61【羊城晚报】报道英国一电视台在一节目中披露一：绵羊长着人心脏、山羊会吐蜘蛛丝、奶牛尺寸是普通牛的3倍大，而猪则会在黑暗中发光！据报道，英国第四频道将在一个富有争议的电视秀中揭开一个转基因动物农场中的惊人内幕，这个电视秀将披露许多通过转基因技术、克隆技术和细胞更改技术饲养出来的古怪动物。其中包括长着人类心脏的绵羊、会吐蜘蛛丝的山羊、在夜晚身体会发光的猪、以及尺寸是普通奶牛三倍大的“施瓦辛格”奶牛。研究转基因动物的科学家们甚至还通过高科技技术，单独培育出了一个人的鼻子组织。据悉，这一电视秀系列将由英国电视记者和生物学家奥利维娅·朱德恩主持，朱德恩是转基因实验的支持者，她和许多科学家都相信转基因食品将是解决全球饥饿问题的万能药，和战胜人类疾病的关键武器。（二）、转基因动物构建方法1）显微注射法：利用纤维操作技术系统和显微注射技术将外源基因直接注入实验动物的受精卵原核，使外源基因整合到动物基因组，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。2）逆转录病毒感染法：用逆转录病毒作为载体去感染受精卵（不适合显微操作)，反转录病毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡，被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。3)胚胎干细胞：胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。这个途径是将外源基因直接导人ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。4）精子载体法：将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带的外源DNA进入卵中并受精，从而使外源DNA整合到染色体中。再利用人工受精过程产生转基因动物5）体细胞移植法：以动物细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆。2.转基因动物的应用利用动物产生有益蛋白：如利用转基因技术，让羊乳汁分泌人凝血因子、让牛分泌人乳铁蛋白和让猪分泌人血红蛋白。利用转基因动物研究遗传病治疗。可以利用这项技术培育缺陷性状矫正动物新品系，在动物身上做实验，可以为这种病治疗提供经验和动物模型。转基因动物可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病人提供健康的器官。如：“具有人类心脏的猪”培育更优良性状的转基因动物。例如，通过将牛的生长激素基因导入到猪身上，就能获得吃的少，生长快，瘦弱多但个头大的转基因猪。培育抗病能力强的禽畜新品种。三干细胞技术（一）概念和分类干细胞：未分化的细胞，是一类具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。可分为：胚胎干细胞：来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以发育成为完整的个体。组织干细胞：存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。如造血干细胞，皮肤干细胞及神经干细胞等（二）、干细胞的基本特征脱分化增殖：能在未分化状态下通过细胞分裂方式进行长期繁殖延续定向分化：在特定的生理条件下，能诱导分化成具有特定功能的分化细胞（三）干细胞技术应用1胚胎干细胞2造血干细胞分布：骨髓、外周血和脐血治疗：白血病、再生障碍性贫血3间充质干细胞（MSC）分布：成年后存于骨膜下和骨髓腔内治疗：造血干细胞移