纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能

中国组织工程研究第20卷第34期2016–08–19出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust19,2016Vol.20,No.34ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5045·研究原著·黄涛，男，1975年生，河北省邯郸市人汉族，主治医师，主要从事口腔医学研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)34-05045-06稿件接受：2016-06-03纳入45只兔空白对照组15只纳米羟基磷灰石组15只羟基磷灰石组15只(1)组织学检测新骨形成情况；(2)新生骨定量分析结果制备牙槽骨缺损模型空白对照组不置入任何材料；纳米羟基磷灰石组置入纳米羟基磷灰石；羟基磷灰石组置入羟基磷灰石纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能黄涛1，陈汉2(1哈励逊国际和平医院口腔科，河北省衡水市053000；2河北医科大学第二医院口腔科，河北省石家庄市050005)引用本文：黄涛，陈汉.纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能[J].中国组织工程研究，2016，20(34):5045-5050.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.005ORCID:0000-0003-2890-7096(黄涛)文章快速阅读：文题释义：纳米级羟基磷灰石材料：与人体内组织成分更为相似，具有更佳的生物性能。纳米羟基磷灰石晶体结构与天然骨的无机成分相似，与人体细胞膜表层多糖和蛋白质以氢键结合，无细胞毒性，具有高度的生物相容性和优良的成骨活性。目前纳米羟基磷灰石被广泛应用于临床多个专业，尤其是在体液作用下，纳米羟基磷灰石会出现降解，释放出处于游离状态的钙和磷，并被人体组织吸收和利用，进而形成新的组织，发挥出骨传导作用。理想的骨替代材料：需满足以下条件：有良好的生物相容性；有骨传导和骨诱导特征；不会传播感染性疾病；抗原性应最小；使用方便；费用低；易消毒性等。但现在应用于临床及实验中的各种材料，却没有一种能够完全符合上述标准。摘要背景：纳米羟基磷灰石的成分与天然骨十分接近，且具有纳米材料的特点，被广泛应用各种骨缺损修复治疗中。目的：通过细胞毒性实验检测纳米羟基磷灰石牙体修复材料的细胞毒性，并观察其修复动物牙槽骨缺损的效果。方法：①体外实验：采用10%、50%、100%浓度的纳米羟基磷灰石材料浸提液(或羟基磷灰石材料浸提液)分别培养牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞各7d，分析材料的细胞毒性；②体内实验：取成年家兔45只，制备牙槽骨缺损模型后随机分组，实验组于骨缺损处置入纳米羟基磷灰石，对照组置入羟基磷灰石，空白对照组不置入任何材料。术后1，2，3周观察各组新骨形成情况。结果与结论：①体外实验结果：不同浓度的纳米羟基磷灰石材料浸提液与细胞发生直接接触之后，细胞毒性在0至1级之间，未发生细胞毒性；②体内实验结果：随着时间的延长，3组新生骨所占视野总面积比例均不断上升，实验组不同时间点的新生骨多于对照组、空白对照组(P0.05)；③结果表明：纳米羟基磷灰石材料无细胞毒性，并且可促进牙槽骨缺损修复。关键词：生物材料；纳米材料；纳米羟基磷灰石；细胞毒性；牙槽骨缺损；骨缺损修复主题词：纳米结构；羟基磷灰石类；组织工程基金资助：河北省卫生厅指令计划项目(20130013)纳米羟基磷灰石修复牙槽骨缺损黄涛，等.纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能P.O.Box10002,Shenyang110180(1DepartmentofStomatology,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hengshui053000,HebeiProvince,China;2DepartmentofStomatology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050005,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Nanohydroxyapatitecompositionissimilartothatofthenaturalbone,andbecauseofitscharacteristicsofnanomaterials,ithasbeenwidelyusedinthebonedefectrepair.OBJECTIVE:Toobservetheeffectofnanohydroxyapatitecompositematerialsintherepairofalveolarbonedefectinanimalmodelsbydetectingitscytotoxicity.METHODS:(1)Invitroexperiment:nanohydroxyapatiteextractswithconcentrationsof10%,50%,100%(orhydroxyapatiteleachingextracts)wereusedtocultureperiodontalligamentfibroblast-likecellsandL-929cellsfor7days,respectively,followedbycellcytotoxicityanalysis.(2)Invivoexperiment:45adultrabbitswereusedtomakeanimalmodelsofalveolarbonedefectsandthenwererandomizedintothreegroups:experimentalgroupimplantedwithnanohydroxyapatite,controlgroupwithhydroxyapatite,andblankcontrolgroupwithnoimplantmaterial.Newboneformationwasobservedat1,2and3weeksafteroperation.RESULTSANDCONCLUSION:(1)Invitroexperiment:afterdirectlyculturedwith10%,50%,100%nanohydroxyapatiteextracts,thecellcytotoxicitywasgraded0to1,indicatingnopresenceofcytotoxicity.(2)Invivoexperiment:inthethreegroups,thepercentageofnewboneareaaccountingforthetotalvisualfieldwasgraduallyinariseovertime.Moreover,theamountofnewbonetissueswashigherintheexperimentalgroupthantheothertwogroupsatdifferenttime(P0.05).Thesefindingsdemonstratethatthenanohydroxyapatitematerialshavenocytotoxicitythatcanbeusedtopromotetherepairofalveolarbonedefects.Subjectheadings:Nanostructures;Hydroxyapatites;TissueEngineeringFunding:thePlannedProjectofHebeiProvincialHealthDepartment,No.20130013Citethisarticle:HuangT,ChenH.Biologicalpropertiesofnanohydroxyapatitecompositefordentalrestoration.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(34):5045-5050.0引言Introduction受到疾病等影响，容易出现牙槽骨缺损的情况[1]。临床对牙槽骨缺损患者进行治疗的过程中，可选择使用不同的修复材料[2-3]。理想的修复材料应该具备良好的生物相容性和骨引导性等[4]。羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石是常用的材料，其中纳米羟基磷灰石的成分与天然骨十分接近，并且具有纳米材料的特点，被广泛应用于各种骨缺损修复治疗之中[5-7]。以往赵熙儒等[8]利用壳聚糖对羟基磷灰石纳米粒进行表面修饰，并通过实验发现，羟基磷灰石纳米粒可作为一种理想的输送载体，将目的基因导入成骨细胞中，并促进成骨细胞生物学活性的增加，是一种十分理想的修复材料。此次实验中，首先通过细胞毒性实验了解纳米羟基磷灰石牙体修复材料的细胞毒性，通过制备动物模型和修复方式，探讨其在动物牙槽骨缺损方面的应用效果，观察其生物性能。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计体外细胞学实验，体内动物观察实验。1.2时间及地点实验于2015年8至12月在哈励逊国际和平医院口腔科完成。1.3材料牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞均由上海盈公生物技术有限公司提供，羟基磷灰石由石家庄科兴新技术产品有限公司提供，纳米羟基磷灰石由北京市意华健科贸有限责任公司提供。实验动物：3月龄雄性家兔45只，体质量3.5kg左右，由安徽省盛鹏实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(皖)2016-001，一般状况良好，饲养于哈励逊国际和平医院动物中心SPF环境。此次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。纳米羟基磷灰石生物性能实验的主要试剂与仪器：试剂与仪器来源MTT液苏州新淳化工有限公司二甲基亚砜北京诺博莱德科技有限公司培养板上海北诺生物科技有限公司超净工作台、病理组织包埋机上海弘顺生物科技有限公司离心机广锐生物(上海)科技有限公司病理组织切片机江苏绿叶生物科技有限公司显微镜上海光语生物科技有限公司免疫酶联仪上海哈灵生物科技有限公司黄涛，等.纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5047体外细胞学实验材料浸提液的制备：取羟基磷灰石与纳米羟基磷灰石，制备材料浸提液。取材料10mg，置于无菌小玻璃瓶内，于120℃、444.82kPa高温高压消毒20min，再用紫外灯照射30min后，无菌环境下加入10mL细胞维持液(含体积分数5%小牛血清，20×104U青霉素和20×104U链霉素)，然后置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中120h，即成材料浸提液，用细胞维持液分别稀释成浓度为10%、50%、100%的材料浸提液备用。细胞毒性检测[9]：对牙周膜成纤维样细胞进行常规原代和传代培养，收集第5代细胞用于细胞毒性实验。将第5代牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞悬液分别接种在培养板中，观察细胞生长情况，待细胞贴壁之后，去掉原培养液，分别添加不同浓度羟基磷灰石与纳米羟基磷灰石材料浸提液，并将新鲜细胞维持液(含体积分数5%小牛血清，20×104U青霉素和20×104U链霉素)培养设为阴性对照组，培养1-7d，添加MTT、二甲基亚砜，测定吸光度值(490nm)。细胞增殖率=实验组A值/阴性对照组A值×100%，按照细胞增殖率判断细胞毒性，大于100%时，细胞毒性为0级；9