纸片法抗菌药物敏感实验操作标准

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准4.3标准比浊管用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准），标定接种菌液浓度。比浊管制备方法如下：（1）0.048mol/LBaCl2，（1.175%w/vBaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比浊管；（2）用光径为1cm的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸收光度应为0.08-0.1；（3）选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4－6ml；（4）将试管帽拧紧，放室温暗处保存；（5）用前，将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒，应更换；（6）每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。5操作步骤5.1制备接种菌液5.1.1增菌法步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度（一般需2－6小时），浓度约1－2×108CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。5.1.2直接菌悬液法步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。5.2接种平板步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟，使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片；（4）注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其他不标准菌液接种平板。5.3贴纸片（1）接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上，直径150mm得平板贴12张纸片，直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散；（2）贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在普通环境中标定的，所以除嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的环境中。CO2与某些因素作用可使抑菌环增大。5.4读取结果（1）经16－18小时培养后，观察结果。菌液浓度适合且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径须包含纸片直径：手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光（黑色无放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24小时后，经投射光检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。（2）肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落不算。如抑菌环内有大量细菌生长，须再移植出来，重新鉴定，重新做药敏试验。变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内，当抑菌环边缘清楚，弥漫生长不算。甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80％以上受抑制），以浓密生长的区域作为抑菌环的界限。用加血的培养基测链球菌，测量抑菌环时不包括溶血环。（3）参照表2的标准对抑菌环的大小作出解释，以敏感、中介或耐药的形式解释结果。6娇嫩细菌Mueller-Hinton培养基只适用于快速生长的细菌，一般不适于测定娇嫩细菌。娇嫩细菌的药敏试验如果要用纸片法做，培养基、质量控制方法、解释标准都须做修改以适合每种细菌。以下介绍的纸片方法用于流感嗜血杆菌，淋病奈瑟氏菌和肺炎链球菌等娇嫩细菌，结果是准确的。其他细菌须用稀释法测定。厌氧菌不能用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性。结果解释8.1抑菌环解释标准抑菌环解释标准见表2、2A、2B和2C。表中所列的敏感类别首先是经过将抑菌环直径与肉汤或平板稀释法测定的最低抑菌浓度（MIC）进行比较，并且根据已知敏感和抗菌株的抑菌环或MIC的群体分布得出的。然后再结合MIC与抑菌环直径的相关分布，结合药物常用剂量的临床药物代谢动力学关系进行分析。最终还要结合临床的治疗效果对体外试验和药理的数据做综合评价。8.2敏感度分级8.2.1敏感表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效。禁忌症除外。8.2.2中介指MIC接近药物的血液浓度或组织液浓度疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β－内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还表示“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释（如某菌种极少对某药物敏感或抑菌环完全不会在此测定范围内，或培养基的差异影响了药物，或药物的中毒界限很窄）。8.2.3耐药被测菌定为耐药是指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β－内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。8.3与敏感度相关的MIC分界点抑菌环直径与用标准方法（一般指肉汤稀释法）测得的MIC呈负相关。表2，2A，2B和2C列出与抑菌环敏感度分界点相关的MIC分界点。这些与抑菌环直径相对应的MIC分界点是根据抑菌环和MIC相关性的研究，以及药物代谢动力学和临床疗效的分析，并且与NCCLSM7标准（MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibiityTestsforBacteriathatGrowAerobically）所定的MIC分界点相似得出的。然而，由于方法学上和原始数据方面的差异，会存在偶然的细小差别。9质量控制方法9.1目的质控的目的是监测以下几个方面：（1）药敏试验操作的精确度与准确度。（2）试验中试剂的情况。（3）操作者的工作情况。使用遗传上稳定的参考菌株即可达到上述目的。9.2质控菌株为了控制药敏试验的精确度和准确度，须从可靠来源获得指控菌株。质控菌株如下：（1）大肠埃希氏菌ATCC25922，(2)大肠埃希氏菌ATCC35218，（3）绿脓假单胞菌ATCC27853,(4)金黄色葡萄球菌ATCC25923，（5）粪肠球菌ATCC29212，（6）流感嗜血杆菌ATCC49247(用于表3A的HTM)，（7）流感嗜血杆菌ATCC49766（用于表3A的HTM），（8）淋病奈瑟氏菌ATCC49226（用于表3B的GC琼脂），（9）肺炎链球菌ATCC49619(用于表3C的羊血M-H琼脂)。大肠埃希氏菌ATCC35218仅用于β－内酰胺酶抑制剂合剂的质控。粪肠球菌ATCC29212（或ATCC33186）用于测试培养基中磺胺抑制剂的水平。粪肠球菌ATCC29212还用于高浓度庆大霉素纸片的质控。质控菌株测试和保存方法如下：（1）须用与临床分离菌所用相同的抗生素测试质控菌株。（2）日常用的质控菌株在大豆酪蛋白消化液琼脂（M-H琼脂）上（普通菌株）或强化的巧克力琼脂上（娇嫩细菌）4-8℃保存，每周传代一次，如具备有长期保存的条件最好长期保存。用适当的保护剂，如50%小牛血清肉汤或脱纤维羊血，在-20℃以下保存。以上方法都不会改变细菌的抗菌药物敏感性。（3）日常使用的质控菌株应至少一个月更换一次，由冻干保存菌种移种或购买新菌种。（4）测定时，先将菌种接种肉汤，孵育4-18小时，然后划种平板，得到单个菌落。（5）按推荐的方法，挑取菌落，制备接种菌液。（6）用这种质控菌株测出的抑菌环平均值如未出现明显差异，该菌株就可以继续用来监测准确度和精确度。如平均直径有明显改变，且该差异不可能是由方法学造成的，表示质控菌株污染或敏感性发生变异，此时应更换新菌株。9.3抑菌环质量控制界限表3，3A，3B和3C列出了一个质控结果允许出现的最大和最小抑菌环直径。一般情况下，每20个测定结果只允许有一个失控(即，超出列表中所列的准确度控制范围)。20个连续测定中任何多于一个以上的失控结果都必须对操作进行修正（如，一旦出现第二个失控结果，马上修正）。另外，如果一个质控结果超过质量控制界限范围中间值上下四个标准差范围时也必须进行修正。修正后，继续观察连续20次测定的结果。注意：本节指的是失控情况下如何处理，务必不要与在实验条件稳定时所进行的一周一次的质量控制项混淆（见9.43节）。9.4质控测定的次数每批新的M-H琼脂或新的抗菌药物纸片必须用质控菌株检测。质控菌株每天与常规工作一起测定，来检测整个操作过程。只有在实验结果合乎要求后，才能减少检测次数。通过以下几个方面可以判断实验是否符合要求。（1）同常规标本一起连续测定质控菌株30天。（2）每种药物对每种细菌，30个抑菌环中（如一个药物对一种细菌的连续30天测定结果），超出表3所给的范围的应不多于3个。注意：本过程是为了建立稳定的制片扩散法药敏试验的质量控制方法，以达到最终可以进行每周监测一次的目的，务必不要与9.3节中有关失控进行修正的措施相混淆。达到以上要求，以后每周至少应测一次。如果试剂有变动，须连续监测。每周监测一次时，如发现有不符合要求的结果，应立即改为每日监测，寻找原因以便解决。按下法查找原因：(1)连续5天测定质控菌株。（2）每种药物对每种细菌，所测的这5个抑菌环不得超出表3的准确度范围。每种药物对每种细菌，连续测定的这5个抑菌环的范围不应超出表3，3A，3B和3C的精确度范围。如果达不到上述要求（只要有一个抑菌环直径超出准确度范围或抑菌环范围大于精确度所允许的范围），必须连续进行每日监测。只有在以后连续测定了30次质控菌株且结果合格后才可以改为每周监测。9.5产生误差常见的原因只要有一次质控结果超出表3，3A，3B和3C的允许范围，应从以下诸方面查找原因。（1）记录质控结果有无笔误；（2）测量抑菌环时是否读错；（3）质控菌株污染或有其他改变；（4）接种菌液过浓或过淡；（5）比浊管没有混匀；（6）孵育温度或孵育环境不对；（7）M-H琼脂有批间差——每批培养基用前应鉴定；（8）药敏纸片在保存和使用中是否失效。一旦发现结果失控，先再仔细检查一下平板，往往很容易解决。如果找不出明显的操作失误，就必须连续5天，每天测定质控菌株。当这连续5个结果均在允许的准确度范围且所有值都不大于允许的精确度最大范围，则可改行每周监测。但只要有一个抑菌环超出准确度范围或精密度允许范围，就必须做每日监测。直到当按9.4节方法另做了30次质控并达到要求后，才可以恢复每周监测。10方法的局限性10.1对各类细菌的适用性本文介绍纸片方法是由快速生长的致病菌标定的，菌株包括肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌。经适当改动可用来测定嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌。对那些未在表中列出的细菌，如使用的培养基不同、孵育环境不同或生长率不同等，尚没有重复性好的标准方法。这类细菌的实验结果不易解释，不应用纸片法测定。10.2易引起误导的结果当用某些抗生素测试某特定细菌时，可能出现严重的误导，主要包括以下几种情况（但不限于这几种）：第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类测沙门氏菌和志贺氏菌；所有β－内酰胺类抗生素（除了苯唑西林、甲氧西林和乙氧西林）测耐甲氧西林葡萄球菌；头孢菌素、氨基糖苷类（除了高水平耐药试验）、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑测肠球菌；头孢菌素测李斯特菌。10.3出现抗药性长期使用某些抗生素治疗，可出现抗药性。所以，开始敏感的菌株可能在开始治疗3到4天内便耐药。肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙雷氏菌对三代头孢菌素，铜绿假单胞菌对所有抗生素，葡萄球菌对喹诺酮类常出现这种情况。10.4质量保证措施须用本标准介绍的质量保证方法监测各种