茶叶中茶氨酸

茶叶中茶氨酸、咖啡碱与色素分离技术简述茶叶是除水以外世界的第一饮料，茶叶中含有多种具有生物活性的物质，如茶多酚、茶氨酸及咖啡因等。大量的研究表明，茶多酚具有抗氧化、清除自由基、降血压、降血脂、抗辐射、防癌抗癌等生物活性和药理作用，茶氨酸具有抗肿瘤、降压安神、促进神经生长等医疗功效，咖啡因具有兴奋大脑皮层，增强机体免疫功能和强心利尿等作用，茶多糖具有降血脂、降血压、降血糖和增强免疫功能等药理作用等，茶色素具有抗氧化、双向调节血压血脂、抗动脉粥样硬化、改善微循环、抑制实验性肿瘤等药理作用，被誉为“药物中的绿色黄金”。因此，安全有效的从茶叶中分离纯化茶多酚、茶氨酸、咖啡因等具有重要的实际意义，本文对茶叶中茶氨酸、咖啡碱与色素的分离技术简述其中。一、茶氨酸分离技茶氨酸是茶叶中特有的非蛋白氨基酸，约占茶叶干重的1%～2%，是近年来国内外天然药物、天然保健品、功能性饮料、饲料添加剂等领域极具潜力的生物活性成分之一。目前国内外茶氨酸的制备技术方法主要有化学合成、生物合成以及从茶叶提制茶多酚、儿茶素后的废液中分离三种方法。茶氨酸分离技术主要有试剂沉淀法、大孔吸附树脂法、离子交换树脂法、膜分离法、结晶法等。本节主要介绍从茶叶提制茶多酚、儿茶素后的废液中分离茶氨酸的技术方法。（一）试剂沉淀法1、碳酸铜沉淀法茶氨酸与碱式碳酸铜生成淡紫色柱状铜盐，利用此性质可将茶氨酸分离，工艺过程通常为提制茶多酚后的废液→过滤→碱式碳酸铜沉淀→稀硫酸溶解→去硫酸根→过滤→浓缩→茶氨酸产品。袁华[7]用2%碱式碳酸铜沉淀茶氨酸，生成的茶氨酸铜盐用1mol/L硫酸解析后，分别用H2S、Ba(OH)2除去Cu2+、SO42-，经过结晶得到茶氨酸，其提取率为34%，纯度为99.28%。2、醇沉法乙醇沉淀法是利用茶氨酸与其它杂质在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异而将其分离的方法，操作简便，因而是茶氨酸粗提物制备的常用方法。在提制茶多酚、儿茶素后的废渣干粉中或经初步纯化后的茶氨酸粗粉中加入一定量无水乙醇，静置后析出白色物质，通过离心或抽滤，得到的白色物质在75℃条件下恒温烘干，即可获得茶氨酸粗品。朱松[8]将经过吸附分离纯化过的茶氨酸浓缩液按无水乙醇：浓缩液=9:1的比例混合，两次沉淀后合并沉淀物，干燥后测得的茶氨酸纯度为95.1%，茶氨酸回收率为54.3%。3、澄清剂法在提制茶多酚、儿茶素后的废渣中含有较多的糖类、蛋白质、多酚及色素等杂质，添加ZTC-II型澄清剂、壳聚糖絮凝剂等，可有效沉淀这些杂质，使茶氨酸得以分离。张星海利用ZTC-II型天然澄清剂，初步实现对茶叶中蛋白质和等杂物去除，去除率分别达到80％、32％，同时茶氨酸的保留率达到98％以上。杨勇在利用儿茶素废液生产茶氨酸工艺中用壳聚糖作絮凝剂，对蛋白质去除率达50％以上，茶氨酸的回收率超过95％。试剂沉淀法是传统的分离茶氨酸的方法之一，该方法虽然操作简单、选择性强，但是由于沉淀剂回收困难、废液排放污染严重、残留沉淀剂安全等问题，目前工业化应用较少。（二）大孔吸附树脂法大孔吸附树脂分离茶氨酸是利用大孔树脂选择性吸附茶氨酸而将茶氨酸与其它杂质分离的方法。常用于分离茶氨酸的大孔吸附树脂有DM130、D101、HPD-400、NKA-9、AB-8、JAD-2000、HPD-100、ADS-7等，其中AB-8树脂对多酚、色素、糖类等杂质的吸附量大，而对茶氨酸的吸附量小，其分离茶氨酸的效率及效果较好。杨勇用该树脂分离茶多酚工业废液中茶氨酸，原废液中茶多酚含量为22.5%，茶氨酸含量为2.1%，经AB-8树脂吸附后溶液中茶多酚浓度为1.25mg/mL，茶氨酸为1.38mg/mL，对茶氨酸的吸附率仅为2.82%。AB-8树脂分离茶氨酸工艺流程如图1所示。（三）离子交换树脂法离子交换树脂法是分离茶氨酸最有效的方法之一，该方法是基于茶氨酸为两性电解质，在非等电点时带有电荷，能与离子交换树脂发生交换而达到分离的目的。常用于分离茶氨酸的离子交换树脂主要有HD-8树脂、717树脂、732树脂、001×7树脂等。其中，阳离子交换树脂中含有的酸性基团如-SO3H（强酸型）或-COOH（弱酸型）可离解出H+离子，茶氨酸中的阳离子可以和H+发生交换而“结合”在树脂上。因此，用于分离茶氨酸的树脂通常为阳离子交换树脂。龚雨顺[11]研究了732、717与HD-8三种离子交换树脂对茶氨基酸的吸附行为（如图2），结果证明了茶氨酸在阳离子树脂上吸附效果最好。离子交换树脂法分离茶氨酸所用的洗脱剂主要氨水、氯化铵和氨水混合液、氢氧化钠溶液等。研究表明，732阳离子交换树脂对茶氨酸具有较好的分离效率和分离效果，在工业化生产中应用较多，茶氨酸提取率大都在50%以上，纯度和回收率均超过90%，其工艺流程如图3所示。（四）膜分离法膜分离法分离茶氨酸是利用膜的筛分效应和电荷效应将茶氨酸与茶叶其它成分离的方法，一般用于离子交换树脂法分离茶氨酸的预处理，以达到初步分离与富集、提高离子交换树脂分离茶氨酸的效率。肖文军[12]研究表明，选截留分子量为3500Da膜超滤pH值为2.8～3.5的儿茶素渣料液，茶多酚、水溶性碳水化合物等大分子物质大部分被截留，其截留率分别为89.90％、92.20％，可获得率为54.50％、纯度为8.92％的茶氨酸料液。该工艺可使料液中茶氨酸纯度由原来的2.29%提高到8.92%，同时，茶多酚、水溶性糖的纯度分别由原来的20.96%、24.06%下降到15.37%、10.83%。（五）高效液相色谱制备法高效液相色谱法是基于柱色谱分离原理制备少量茶氨酸纯品的有效方法，具有纯度高、得率高、精密好等优点，其关键在于色谱条件的优化。张莹[13]等采用SpherigelC18柱，流动相：水溶液(用甲酸调pH≈3)，紫外检测波长210nm，柱温30℃，样品浓度为50mg/mL，流速6.0mL/min，最大上样量为1.5mL，即75mg等制备色谱分离条件，得到了茶氨酸纯品约26.4±0.5mg，回收率为70.4％。肖伟涛[14]等采用反相HRC18柱（300mm×19mm，6μm），柱温为室温，检测波长215nm，流动相为0.1%甲酸水溶液，流速5ml/min等色谱条件，获得了纯度大于98%、收率大于60%的茶氨酸。（六）结晶法根据茶氨酸具有易溶于水、不溶于无水乙醇及丙酮等溶剂的性质，选择以水为主溶剂、以乙醇、丙酮等与水互溶、对杂质有选择性溶解能力、沸点较低的辅助溶剂，可将茶氨酸结晶析出，从而达到进一步纯化茶氨酸的目的。目前工业生产中多以乙醇作为辅助溶剂，其工艺流程通常为：茶氨酸粗品→配成10%（W/V）的水溶液→加入4倍体积乙醇→常温震荡混匀，静置1h→8000rpm/min离心→取上清液→60℃减压浓缩成80%（W/V）溶液→冷却→加入4倍体积乙醇→0℃冷藏24h，产生结晶→4℃、8000rpm/min离心→干燥→茶氨酸。研究表明，通过结晶方法，可得到了纯度大于90％的茶氨酸产品。二、茶叶咖啡碱的分离咖啡碱是茶叶主要的生物碱之一，一般含量为2%～5%，易溶于热水、氯仿、二氯甲烷，能溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯和冷水，难溶于乙醚和苯。从茶叶中分离咖啡碱是获取咖啡碱的有效来源之一，但由于咖啡碱是一种分子结构类似于咖啡因的生物活性物质，对其工业化生产需有国家安全部门的生产许可方可进行。根据咖啡碱的理化性质，分离咖啡碱的方法主要有溶剂萃取、超临界CO2萃取、大孔吸附树脂分离、升华等方法。（一）溶剂萃取法溶剂萃取法是目前国内用于分离咖啡碱使用最常用的方法之一，该方法的基本原理是根据咖啡碱易溶于乙醇、热水、二氯甲烷、氯仿等溶剂的性质，利用这些溶剂将茶叶中的咖啡碱和其他成分进行分离过程，使用的溶剂大多为二氯甲烷、氯仿等。影响溶剂萃取咖啡碱萃取效率及效果的因素主要有料液比（物料与萃取溶剂的体积或质量比）、萃取时间、萃取温度、萃取次数和料液pH值等，工艺流程如图5所示。崔丽[17]等研究表明，以二氯甲烷为萃取溶剂，以固形物含量为10%的绿茶浓缩液为原料，采用萃取温度35℃、摇匀时间35min、静置萃取时间100min、料液比1:2.5、萃取2次等工艺参数，咖啡碱得率、纯度可分别达到85.13%、43.37%。（二）超临界CO2萃取法超临界CO2对咖啡碱选择性高，对咖啡碱的分离效果好。国外利用超临界CO2技术从咖啡豆中脱除咖啡碱的工艺已相当成熟，在茶叶咖啡碱萃取方面，主要用于茶或含茶制品中的咖啡碱脱除，以生产加工低咖啡碱含量的茶或含茶制品。影响超临界CO2萃取分离咖啡碱效率与效果的因素主要有待分离物料的含水量、萃取压力、萃取温度、夹带剂等。周海滨[18]等研究超临界CO2脱除茶叶中咖啡碱工艺，在25MPa、40℃、30%乙醇作为夹带剂连续萃取4h的条件下，咖啡碱脱除率为83%～96%。超临界CO2分离咖啡碱的方法具有溶解性大、无毒安全、工艺过程简单等优点。在实际操作中，咖啡碱的脱除效果比较理想，但脱咖啡碱后茶叶的自然滋味容易变淡，茶叶中的香气会减弱。同时，较高湿度较高温的度萃取过程也易造成了干茶色泽变黄汤色也变黄[19]。（三）升华法咖啡碱具有升华的特性，当温度达到120℃以上时开始升华，到180℃时大量升华。咖啡碱的升华分为两种：直接升华法和间接升华法。直接升华法：直接升华法分离咖啡碱是将茶叶直接放置于炉内灼烧，随着温度的上升，咖啡碱和其他挥发性物质会气化，在茶叶上方覆盖一层粗松物质吸附杂醇油等杂质，咖啡碱会在粗松物质表面冷却结晶，其工艺流程为：茶叶（或茶末）→180℃以上升华→冷却得咖啡碱粗品→热水溶解，漂洗→静置、冷却→过滤→取滤液进行结晶→干燥→咖啡碱纯品。间接升华法：间接升华法分离咖啡碱是将茶叶咖啡碱提取先出来，再采用升华法对提取出来的咖啡碱粗品进一步纯化。工艺技术流程为：茶叶（或茶末）→乙醇提取两次→减压浓缩→加入稀硫酸除杂→过滤→取滤液蒸干→180℃以上升华→冷却→结晶→干燥→咖啡碱纯品。影响升华法分离咖啡碱效率与效果的因素主要有温度、压力、待升华物料的含水量、物料形状与粒度等。研究表明，常压下，咖啡碱的升华温度在120℃～238℃之间为宜，温度越高，升华越快、越彻底，而减压可大大降低升华所需温度而不影响咖啡碱升华的效果。同时，比表面积大、内部组织结构破碎度高以及物料含水量适度的物料，可加快咖啡碱的升华速率。升华法分离咖啡碱具有工艺简单、无溶剂残留、产品不含结晶水、纯度较高等优点，但得率较低，咖啡碱损失较严重，工业化应用极少，一般仅用于脱除茶或含茶制品中的部分咖啡碱、达到降低其含量的场合。（四）大孔吸附树脂法根据茶叶提取液中生物活性成分的组成，大孔吸附树脂分离咖啡碱通常是采用二级树脂法，即选择一种对茶多酚、咖啡碱其中一种成分优先吸附的树脂作为第一级树脂，通过梯度洗脱层析技术将其纯化，然后以富含另一种成分的层析液为原料液，由第二级树脂将其吸附，经过洗脱、浓缩、干燥即可得到第二种成分。影响大孔吸附树脂法分离咖啡碱效率与效果的因素主要有提取液浓度、pH值、上样量、上样流速以及洗脱剂种类、浓度、洗脱体积、洗脱流速等。值得注意的是，在二级树脂法分离咖啡碱过程中第一级洗脱溶剂的选择，要能够有效的将咖啡碱洗脱下来的同时使茶多酚保留在柱中。同时，第一阶段洗脱完毕后，树脂柱内残留有大量的洗脱剂，为避免第一阶段洗脱剂混入第二级洗脱液中影响产品的纯度，需在第二级洗脱剂洗脱前用蒸馏水淋洗树脂，以减少对产品的影响。李振武用二级树脂法分离茶多酚和咖啡碱，经过二级树脂吸附得到的咖啡碱粗品，其含量为48.65%。三、茶色素的分离茶叶中的色素物质按照其来源，可分为茶鲜叶中的天然色素和茶叶加工过程中形成的色素，其中前者主要包括叶绿素、叶黄素、花色苷等，后者主要包括茶黄素、茶红素、茶褐素等；按照其溶解性，可分为脂溶性色素和水溶性色素。由于茶叶色素分子中含有活性酚羟基，具有多种生物活性，是一类极具开发潜力的茶叶生物活性成分。本节主要介绍茶红素、茶黄素的分离。（一）茶黄素的分离茶黄素是红茶加工中在多酚氧化酶的作用下，由茶多酚/儿茶素类及其衍生物氧化聚合而来且溶于乙酸乙酯、呈橙黄色的一类化合物，约占红