荧光偏振分析方法

第6章荧光偏振分析方法传统荧光偏振技术及发展情况概述1纳米增强荧光偏振一般策略及应用2§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述光的偏振性非偏振光原理图偏振光原理图自然光在各个方向振动是均匀分布的一束光线都在同一方向上振动荧光偏振（FluorescencePolarization，FP）Polarizedexcitation100%0%100%0%1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性；如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述如何衡量：偏振值的定义P=-+偏振值一般以mP（毫偏）来表示r=-+2对于完全偏振发射，P=r=1；对于自然光，P=r=0§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述偏振值的影响参数偏振值衡量荧光分子的运动性)1)(311(3110VRTPP§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过68.5度角时所用的时间；分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常数有关。20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化分析领域。20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述荧光偏振分析的一般步骤•利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。•如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位mP）。•通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势(特别是不生成有害的放射性废物)并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光偏振是真正均相的，允许实时检测(动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的最佳解决方案。荧光偏振技术的优势:§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述常用的测试仪器及配件国内外研究现状及发展动态分析§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述1.荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术。荧光偏振免疫分析原理§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述1.荧光偏振免疫分析近年来，FPIA备受生物、化学、医学专家们的亲睐，有关FPIA在临床化学、农药残留分析、食品安全、环境监测中应用的报道逐年增加，成为生化分析和环境监测中强有力的工具。优点：均相分析无需分离、迅速、灵敏、无放射性污染、重现性高；缺点：FPIA不如酶联免疫吸附测定(ELISA)灵敏，且荧光标记物可能会与样本中的基质特异性结合，使荧光偏振值增加，产生一定干扰。§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要部分，因此成为分子生物学研究的一个热点荧光偏振技术为研究蛋白质-核酸相互作用提供了一个免分离、免放射性的途径§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述2.蛋白质-核酸相互作用2.蛋白质-核酸相互作用核酸适配体(aptamer)是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成本低，已广泛应用于分析应用领域传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理Biosens.Bioelectron.2012,32,148-154.§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述3.核酸分析Chem.Commun.2011,47,3478-3480.改进传统的荧光偏振检测方法，通过引入酶促反应扩增检测信号应用于超灵敏检测特异性DNA的检测。超灵敏检测DNA§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述3.核酸分析NucleicAcidsRes.2003,31:e70.实时监测DNA双链的形成和解链过程§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述4.水解酶催化反应Chem.Rev.2010,110,2685-2708.实时监测蛋白酶催化过程•蛋白酶对机体的新陈代谢和生物调控起到非常重要的作用；•蛋白酶酶活的评估有助于理解特定的生化途径、开发治疗药物。§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述Anal.Chem.2009,81,7468-7473.非竞争法检测小分子化合物5.小分子分析§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述空间构象变化Anal.Bioanal.Chem.2011,401,3229-3234.磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台5.小分子分析§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述Chem.Commun.2012,48,10004–10006.多元检测方法5.小分子分析§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述传统荧光偏振分析技术面临的挑战：荧光偏振变化量较小，灵敏度较低解决的方案)1)(311(3110VRTPPMAP探针(MassAmplifyingProbe)§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述Anal.Chem.1995,67,3945-3951.核酸检测蛋白质增强荧光偏振§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述Anal.Chem.2012,84,5535-5541.小分子检测蛋白质增强荧光偏振§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述凝血酶(thrombin)小分子检测Anal.Chem.2012,84,7203-7211.蛋白质增强荧光偏振§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述单链结合蛋白SSBP(Single-strandbindingproteins）离子检测Analyst,2012,137,2770-2773.特殊结构核酸增强荧光偏振§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述一.调节机体和细胞的渗透压二.调节体液的酸碱平衡三.参与体内蛋白质和糖类的代谢四.维持正常的神经兴奋性和心肌运动K+的作用离子和小分子检测Chem.Commun.2014,50,2049-2051.特殊结构核酸增强荧光偏振§6.1传统荧光偏振技术及发展情况概述与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有潜在的应用价值。纳米材料§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,8386-8389.汞离子检测荧光偏振探针检测限达到0.2ppb，比传统荧光偏振方法提高3个数量级，检测时间只需20分钟，具有良好的特异性MAP探针§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用AuNP-DNASystemDNA-DNASystemAuNPEnhancement0.2ppbQuantitativeAnalysisAnal.Biochem.2010,401,47-52.DNAzyme自组装荧光偏振探针MAP探针§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Chem.Commun.2012,48,7480-7482.纳米二氧化硅颗粒增强荧光偏振探针§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Chem.Commun.2011,47,4763-4765.核酸酶检测及药物筛选§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用BiosensorsandBioelectronics,2013,41,569-575.基于链置换反应开发的纳米金颗粒增强荧光偏振探针§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用J.Mater.Chem.B,2013,1,2018-2021.T4polynucleotidekinaseactivityandinhibition§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Chem.AsianJ.2014,9,2755-2760.聚乙烯纳米颗粒增强荧光偏振信号放大分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用金纳米颗粒、硅纳米颗粒等虽然能有效增强荧光偏振值，但是探针与纳米颗粒需要复杂的共价连接；开发一种普适、简单的荧光偏振增强剂仍然是一个重要的任务。§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用纳米材料的生物功能化方法非共价功能化途径静电相互作用π-π堆积作用范德华力碳基纳米材料：石墨烯，碳纳米管，碳纳米颗粒等ssDNA/dsDNA与碳基纳米材料之间的相互作用差别悬殊与DNA发生π-π堆积作用与多肽发生π-π静电作用等§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Chem.Commun.2013,49,1942-1944.氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用“signal-off”“signal-on”Anal.Chem.2013,85,1424-1430.氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用MaterialsScienceandEngineeringC2014,38,206-211.碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用BiosensorsandBioelectronics,2014,54,285-291.碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用Chem.AsianJ.2014,9,87-92.碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法ChemBioChem2010,11,494-497.§6.2纳米增强荧光偏振一般策略及应用ActaChim.Sinica2013,71,1620-1624.二氧化钛纳米棒增强荧光偏振信号分析方法