荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/L(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB)试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。-----0．2M的NaH2P04溶液:31.2gNaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液:71.632gNa2HP04·12H2O加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB):19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。2、0.03mol/L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl，150ml磷酸缓冲溶液(PB)，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02MPBS溶液：取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01MPBS溶液：取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl缓冲液的配置---121.1gTris(三羟基氨基甲烷),加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl---用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml高压灭菌，4℃冰箱保存。5、10%SDS---10gSDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤称取SDS时需戴口罩！6、0.5MEDTA（pH8.0）溶液的配置----186.1g乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机)-----用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。7、杂交缓冲液配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：360μL5MNaCl；40μL1MTris—HClxμL100％甲酰胺（见下表）yμL无菌水（见下表）2μL10％SDS0.22μm孔径的滤膜过滤，4℃保存。表1配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积甲酰胺浓度（%）甲酰胺体积x（μL）无菌水体积y（μL）0015985100149810200139815300129820400119825500109830600998357008984080079845900698501000598551100498（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度（%）5MNaCl溶液（mL）1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺体积x（mL）无菌水体积y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下：ZμL5MNaCl1mL1MTris-HCl(pH7.6)无菌水加至50mL50μL10％SDS500μLEDTA表2根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度%NaCl体积z（μL）NaCl最终浓度（mM）090009005640064010460046015328032820225022525159015930112011235800804056056454004050280285520020不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度（%）1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)0.5MEDTA（mL）5MNaCl溶液（mL）无菌水体积（mL）2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI)常备：1mgµl-1需要稀释为：1µgµl-1灭菌储存在-20℃(用铝箔覆盖管子)DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的预处理：（1）玻片预处理1）玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（4~5次每次10min），然后用清水浸泡过夜；2）硅化处理：第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好4°C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）(2)黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约1min，取出用高压灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4℃保存备用2、荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表）3、样品的制备与固定（1）用已灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL，加适量灭菌蒸馏水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约0.5ml进行后续处理。（2）将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4℃固定24小时，（3）然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml0.0lmol/LPBS以10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。（4）采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于−20℃保存备用4、样品的预处理（1）用微型振荡器将样品混合均匀，取10μl样品在载玻片上涂抹20mm×20mm大小（不要太大），37℃的烘箱热固定2h，最高温度不超过60℃（2）风干后于50％、80％、95％的乙醇中各脱水3min，自然风干。（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中，用50%乙醇淹没载玻片，脱水3min，取出放入第二、三个瓷盘，然后用80%乙醇脱水，96%乙醇脱水。脱水后的80%、96%乙醇回收。）脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20℃的条件下保存几个月5、原位杂交探针浓度为50ng/μL，在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一定的湿度。用移液枪分别取24μL的杂交液和1μL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。所有有关探针的操作在处理时都应避光处理！探针种类温度（℃）时间（h）甲酰胺浓度%备注EUBMIX46520同步染色法AOBMIX46355重复染色法NOBMIX46540重复染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48℃的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗15～20分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。7、DAPI染色每个玻片用10μLDAPI（用甲醇稀释至1μg/μL）滴加到载玻片样品上，在冰上染色10min，用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite-oxidizingbacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPAO651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探针浓度均为50ng/μL；bcNIT3为硝酸菌探针NIT3的竞争探针。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC（绿色）492nm528nm10(Zeiss)DAPI（蓝色）365nm418nm02(Zeiss)CY3（橙色/红色）554nm570nm15(Zeiss)CY5（红外线检测）650nm667nm26(Zeiss)HEX探针的选用选用EUBMIX(EUB338、EUB338Ⅱ、EUB338Ⅲ)来检测活性污泥中的全部的细菌。选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，选用AOBMIXNOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria，用PAO651来检测优势菌种Rhodocyclus，杂交后用4¢,6-diamidino-2-phenylindoledihydro-chloride(DAPI)(1:1,000稀释)和PHB进行复染样品。试剂与材料：NaH2P04·2H20，Na2HP04·12H2O；NaCl；多聚甲醛PFA；150g三羟基氨基甲烷(Tris)，浓HCl，NaOH；十二烷基硫酸钠（SDS）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；100％甲酰胺；DAPI；载玻片，盖玻片，吸水纸，瓷盘（带盖）；