荧光定量操作不同仪器

SYBR®PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM*1DNA模板（100ng）*22μldH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*3*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。*2在25μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为25μl。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序：Hold(预变性)Cycle:195℃30秒PCR反应*4Cycle:4095℃5秒60℃30-60秒Dissociation*4：PCR的最适反应条件请参考「实验条件的选择」◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。