组织培养技术在葡萄无菌苗生产的应用

组织培养技术在葡萄无毒苗生产的应用谢文华21516063摘要:在葡萄种苗选育中，传统方法时间长，效率低，难以满足大规模的农业生产要求，组织培养作为一种新兴的技术与研究方法，利用包括茎尖、胚轴、叶柄、叶片、胚珠等多种外植体、多水平的再生途径，广泛应用于葡萄脱毒、快繁。现对目前生产上主要发生的葡萄病毒病、脱毒培养技术进行简要综述，并对当前的研究进展做以展望。关键词：葡萄种苗、病毒病、脱毒葡萄(ViniferaL.)隶属葡萄科葡萄属的藤本植物，在世界上分布范围广，栽培面积大，其产量仅次于柑橘位居果树中第2位。当前，葡萄与葡萄酒已成为国际重要商品，每年葡萄生产量的80%均用于制酒，酿酒葡萄品种的培育与种植前景十分广阔。。但葡萄病毒病迅速蔓延,严重威胁葡萄产业的健康发展。对葡萄病毒病的防治除拔除病株、严禁采用带毒接穗和砧木外,最根本的措施就是大量培育无病毒苗木。利用组织培养进行脱毒不但突出了生产的实用性,而且可以节省人力物力,使脱毒工作更加简便有效。1.葡萄主要病毒病1.1葡萄扇叶病葡萄扇叶病又名葡萄退化，世界葡萄产区均有分布，在我国普遍发生，是影响我国葡萄生产的主要病害之一。病毒的不同株系引起寄主产生不同的反应，有3种症候群：传染性变形、黄化、镶脉或称脉带。葡萄扇叶病毒属线虫传多角体病毒组，机械传染，病毒颗粒同轴，直径30纳米，具角状外貌。扇叶病毒极易进行汁液接种，病毒可侵染胚乳，但不能侵染胚，故葡萄种子不能传播，但试验草本寄主可由种子传播。病毒的自然寄主只限于葡萄属。1.2葡萄卷叶病葡萄卷叶病具半潜隐特性，在大部分生长季节不表现症状，多数欧亚种病株在果实成熟阶段才出现症状。在采收后到落叶前叶片症状最明显，叶缘反卷，脉间变黄或变红，仅主脉保持绿色；有的品种则叶片逐渐干枯变褐。卷叶病发生于葡萄的所有品种。症状随品种、环境和季节而异。春季的症状较不明显，病株比健株矮小，萌发迟。葡萄卷叶病可能是由复杂的病毒群侵染引起，其成员大多属黄化病毒组。1.3葡萄茎痘病葡萄茎痘病的主要特征是砧木和接穗愈合处茎膨大，接穗常比砧木粗，皮粗糙或增厚，剥开皮，可见皮反面有纵向的钉状物或突起纹，在对应的木质部表面现凹陷的孔或槽。葡萄染茎痘病后长势差，病株矮，春季萌动推迟月余，表现严重衰退，产量锐减，不能结实或死亡。是病毒，有关毒源种类尚在研究中。2葡萄苗脱毒培养技术2.1培养基的选择葡萄苗的培养基一般分为两类，一类是分化培养基，在生产上常用的是1/2MS+6-BA+IBA+GA,不同品种的6-BA和GA的浓度不同。另一类为生根培养基在生产上常用的是1/2MS+生长素。培养基琼脂浓度0.75%。培养基中蔗糖浓度和各种生长素的浓度需要根据不同品种进行调配，选定最适浓度。在生根培养基中生长素的选用上，有研究发现IBA效果要比NAA的好【1】2.2采取材料对消毒效果的影响不同时间取材，消毒效果不同，随着取材时间的推迟，葡萄病害越南来越重，消毒效果越来越差，而且消毒成功的茎段成苗也越来越少.采集外植体时，应采集正在生长的葡萄树的上部嫩枝，停止生长的植株不宜采取[2]同时，外植体的采集不宜在雨天或者雨后立即进行。雨水会携带大量病菌，从而加大消毒的难度。另外，在郎凤红的试验中她发现在消毒效果和成苗率上，赤霞珠要优于蛇龙珠、梅鹿特及霞多丽。因此在选择组培苗品种时候应该优先考虑消毒效果和成苗率高的品种。2.3不同激素在诱导葡萄愈伤组织的影响植物激素是影响植物组织培养中愈伤组织、茎尖分化和生根关键因素之一，具有刺激形成层细胞分裂、诱导愈伤组织和不定芽的形成等生理作用[3-4]目前，2,4-D在葡萄愈伤组织的诱导中使用较为广泛，鲍雪珍、卢炳芝等通过使用一定浓度的2,4-D诱导胚性愈伤组织发生[5-7]。而在张丽关于5个酿酒葡萄组织培养的实验中却发现2，4-D并不能很好的诱导出酿酒葡萄的愈伤组织，但是利用NAA0.5mg/L与6-BA.2.0mg/L组合对愈伤组织诱导效果明显，另外在她的实验中，添加GA30.2mg/L到培养基中，对五个品种的茎尖愈伤组织的分化效果有明显的提高，从这些结果来看，激素的水平和种类不同品种间作用效果差别较大，每个品种的组织培养及再生体系建立时，需要对激素浓度进行较多的调整才能找到最适浓度，这也是组织培养技术的关键之一。2.4葡萄苗脱毒技术目前使用的脱毒技术主要分四种：热处理脱毒、茎间培养脱毒、花药培养脱毒和低温脱毒。热处理脱毒法是利用高温下植物组织中的病毒部分或者全部失活的方法。利用某些病毒受热后不稳定的特点，将葡萄完整植株或组织器官进行热处理，使病毒失去活性。但这种方法局限太大，缺点很明显，对一些耐热病毒不起作用，从外植体本身来讲，也只适合一些耐热性好的品种，因此作为单一的脱毒技术在生产上使用效果不佳。茎间培养脱毒是目前应用最广的脱毒技术之一[8-9]其原理是由于病毒没有自己的新陈代谢和病毒复制途径，因此病毒的复制是依赖寄主细胞的蛋白质和核酸合成机理和机制的路径进行的。因为病毒复制抑制剂对寄主细胞有毒，所以病毒控制是很困难的。大部分病毒不攻击芽的分生组织，因为分生组织细胞的增殖要比病毒的复制速度快，这就使茎尖培养脱毒成为可能。一般来说，可直接从大田中获取的葡萄茎尖以组织培养方式获得无菌苗，通过病毒检测后，再切取无菌苗的茎尖分化成苗，栽植后再经病毒检测证明无毒后即可作为原种母树，用脱毒母树提供无病毒营养系砧木或优种繁殖材料。而一些研究发现，联用热处理脱毒技术和茎间脱毒技术可以进一步地提高脱毒效果。张福庆等［10］用通过茎尖培养＋热处理的方法对赤霞珠、黑比诺等酿酒葡萄品种进行脱毒培养，成功地脱除了葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒，脱毒率达到100%。花药培养脱毒，其机理目前尚不太清楚，在葡萄中使用花药培养脱毒的暂时还没有报道，但是有人已经利用草莓花药成功获得了脱毒苗。花药培养脱毒率可达100%，且可省去病毒鉴定的程序，因此被认为是获得无病毒植株的最佳途径。然而与茎间培养脱毒方式相比，花药培养脱毒，在诱导外植体分化上相对困难，而且培养的周期较长，这使得它的应用受到了一定的限制。低温脱毒法（将外植体长期暴露在低温下然后进行芽尖培养的方法）在脱毒方面很成功。芽尖低温培养的脱毒率很高。当使用低温脱毒时，选择只允许有限数量外植体存活(那些最不同的细胞)的条件，从而消除一大批感染病毒的组织。因此，低温疗法可获得数量比传统茎尖培养高得多的脱毒再生苗［11］。低温脱毒法已成功从大量的植物品种中消除病原体:马铃薯、甘薯、葡萄、柑橘、覆盆子、香蕉［12］。超低温脱毒是一种比茎尖脱毒更理想的脱毒方法，操作简便，更适合批量化、产业化生产。3展望随着葡萄产业的不断发展，葡萄栽培面积不断扩大，由于葡萄主要采用营养繁殖的方式，遭受病毒病的风险也不断增加，各种由于病毒感染，而导致产量下降，品质劣变的问题将是种植业面临的一个艰巨挑战，采用组织培养脱毒方法来生产无病毒苗，是防治葡萄病毒病的有效途径。单一的脱毒方法，在一定程度上可以降低病毒病的风险，但是脱毒率和实际操作上都会各自存在不足，若将几种脱毒技术结合使用，将会取得较好的效果，综合脱毒在培养葡萄无毒苗的生产运用上将成为一种趋势。在脱毒技术上，花药培养脱毒的脱毒效果极佳，将会是以后脱毒的一个新方向，如果能运用到葡萄苗的脱毒上，并通过不断试验，改进其成苗效率低的缺陷，将会是葡萄产业的一大福音。4参考文献[1]刘永清，昌秀葡萄组织培养脱毒技术研究[J].福建果树，2004（2）[2]郎凤红，等酿酒葡萄秋季消毒技术及影响成苗因素研究[J].宁夏农林科技2012，53（05）：24-2[3]吴金平，宋志红，杨朝柱，等．魔芋茎尖组织培养及快速繁殖技术研究［J］．长江蔬菜，2008（16）：35-36[4]朱美虹，王浩宇．草莓组培快繁技术［Ｊ］．农村科技，2010（3）：40-41．[5]鲍雪珍,张克忠,沈利爽,等.葡萄胚性愈伤组织无性系的建立保持和植株再生的研究[J].山东大学学报:自然科学版,1995,30(3):105-111.[6]卢炳芝,于向荣,郭飞跃,等.葡萄花丝培养中的胚胎发生[J].果树学报,1995,12(增刊):37-40.[7]肖宇,张朝红,支玉玺,等.葡萄花器官体细胞胚的诱导和植株再生[J].果树学报,2011,28(5):888-892.[8]宋瑞琳．柑橘良种无病毒苗木的繁育技术［J］．福建农业科技，1993（1）：26-27[9]王国平．我国果树病毒病发生危害现状与防治对策［J］．北方果树，1997（1）：8－10．[10]张福庆，于向君，薛俊，等．酒用葡萄组培脱毒快繁技术的研究［J］．中外葡萄与葡萄酒，2001（1）：14－16．[11]WANGQC，YALKONENJPT．Eliminationoftwoviruseswhichinteractsynergisticallyfromsweetpotatobyshoottipcultureandcryotherapy［J］．JournalofVirologicalMethods，2008，154:135~145．[12]WANGQC，YALKONENJPT．Cryotherapyofshoottips:novelpathogeneradicationmethod［J］．TrendsinPlantScience，2009，14(3):119~122．