第五章X射线晶体衍射技术.

X射线晶体衍射技术在蛋白质晶体结构测定中的应用X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。揭示分子结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-raydiffractionmethod）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。发展历史1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray;1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖.1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用X-射线结构分析基本原理X-射线是波长很短的电磁波，约0.1--100Å。结构分析用的是单色X-射线，其波长在1Å数量级，相当于分子中原子之间的距离。用于结构分析用的仪器是X-射线仪。由X-射线管、滤波器、高压系统（30-50KV)、真空系统(10-4-10-5mmHg柱）和照相机组成。工作原理：由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色X-射线。单色X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得到衍射图，然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。。用X-射线衍射法测定晶体结构是根据晶体中原子重复出现的周期性结构。当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d与入射角的X-射线波长λ、入射角θ之间的关系能满足布拉格方程式。则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射图谱。不同物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下来的衍射图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分布和分子的空间结构。dd平行光束原子层θ晶体的衍射X射线晶体结构分析是利用晶体的X射线衍射现象来测定晶体及分子的结构。X射线衍射可简单理解为当一束平行的X射线投射到晶体上时，大部分入射线穿过晶体沿原方向前进，而部分射线却偏离了入射方向。X射线源入射线晶体衍射线晶体结构的基本知识日常所见晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图上斑点的位置与黑度。衍射线方向：确定晶胞的大小和形状；衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。三、蛋白质X射线晶体结构测定程序样品处理：培养大的、质量好的晶体；蛋白质结晶和晶体生长晶体衍射数据的测量和处理；位相确定；分子模型的建立和修正获得好的晶体是结构分析中最关键的一步由于球状蛋白分子量大，且表面基团的构象较不稳定，欲获得排列有序的晶体比较难。所形成的晶体在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由溶剂分子所占有，绝大部分在晶体中是无序的。晶体的蛋白质分子之间仅少量的区域发生接触，这些区域的相互作用是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子层发生作用。这是为什么由X射线晶体学测定的蛋白质结构与在溶液中测定的蛋白质结构几乎相同的主要原因。欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完好结晶的关键之一。重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。一个蛋白质样品要想使其能结晶，至少需要97%的均一性。生物大分子的晶体培养要求要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分析的晶体。这里所谓“适合于”包括两层意思：晶体内部结构要具有有序性．是单晶，不是孪晶，否则无法得到具有结构本身特点的衍射花样；晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。一般讲分子量为50000左右的蛋白质分子，需要0.3mm3或者更大的晶体，才有可能作高分辨率的结构分析。对于分子量更大的蛋白质分子，那就需要更大的晶体。为了满足上述要求，首先要使生物大分子结晶，然后设法长大。蛋白质结晶过程是一个有序化过程蛋白质晶体培养一般规律蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶核，并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶液能开始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等)而结合到晶核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个体系能量降低而形成晶体。过饱和溶液蛋白质结晶要点蛋白质的分子量很高，几何形状较复杂，表面带多种电荷；分子间相互作用或相互结合的点很多，而可能形成有序排列的关键结合点和几何匹配位置又很少；在外界条件(如PH、温度、不同溶剂等)的影响下，分子构象容易产生某些变化；在蛋白质结晶时．必须保持在水合状态，或者在生理pH和温度条件下。要使生物大分子结晶和生长出大的晶体．最关键的是控制过饱和度的量和速度．过饱和度要低，而速度要尽可能地慢。蛋白质结晶技术--悬滴法该法适用于微量的筛选结晶条件。每个蛋白质溶液的样品只需5u1或者10ul，平衡液只需lml。每次实验可根据需要设计，如可先配制一系列不同浓度的沉淀剂溶液，作为平衡液，然后转移到各个封闭小室内，与含有低于平衡液50％的沉淀剂的蛋白质悬滴液扩散平衡。最后根据实验结果筛选出一种沉淀剂浓度作为最佳结晶条件。具体实验可采用16孔的塑料组织培养盒进行、每个孔内加入一定量的平衡液：每一个蛋白质母液悬滴加在预先硅化好的盖玻片上，然后把盖玻片倒盖在小池上。为防止蒸发扩散时漏汽，必须在盖玻片与池边缘间加少量凡士林密封。盖片悬滴平衡液蛋白质结晶技术--坐滴法坐滴法原理与悬滴法相同，不同之处仅为液滴体积增大，如50ul或更大。这种方法较易生长出大的晶体，重复性较好，但是蛋白质用量较大，适合于巳大体知道结晶条件，或者有足够量的样品可供使用。其缺点是晶体有时贴在容器底部而不易取出．导致损坏晶体。盖片蛋白质溶液平衡液蛋白质结晶技术--平衡透析微量扩散小室法原理：利用半透膜允许小分子透过而不允许大分子透过的性质，来调节蛋白质溶液的离子强度或pH值，使蛋白质溶液慢慢地接近过饱和度。优点：通过有控制的扩散，改变结晶的条件，从而慢慢地到达晶核形成点。晶体的生长亦可不断地调整、已经产生的沉淀或者微晶可通过外部条件的改变重新溶解。这种方法可以在低离子强度条件下应用传统的盐析方法结晶，它既适用于大批量的结晶，亦可应用于微量的结晶。蛋白质母液加在小室内，上端封一半透膜，然后把小室放到相应的平衡透析液内。蛋白质母液内的条件通过半透膜与外部溶液平衡透析而改变。平衡液小室蛋白质溶液橡皮环透析膜在蛋白质晶体中可能出现的11种对称类型表示在纸面上方表示在纸面下方生物大分子的晶体特征氨基酸、核苷酸、单糖的分子以有序的晶体型式存在，以氢键为特征。晶胞的大小一般为0.5-2nm。这些简单的分子中的原子数目可达l02，它们是几乎所有生物结构的建造单元。肽、类固醇、激素、维生素以及脂类等的一个分子中所含的原子数达102-103．从生物学的观点看是很小的分子。但对于x射线晶体学来说，是非常复杂的。它们以晶体或液晶等有序性型式存在。其晶胞大小为l-3nm。纤维状蛋白质、球状蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的一个分子中或一个亚基中含有的原子数目可达102一105。这些生物大分子是现代晶体学研究最活跃的领域。它们以纤维结构、层状结构或晶体型式存在，晶胞的大小或链的周期一般可从几个-20nm。生物膜、核蛋白、染色体、核糖体及病毒等是更为复杂的生物学对象。它们是由大量生物分子如蛋白质、核酸、脂类或糖类等结合或组装而成的。在一个分子或一个亚基中的原子的数目可达102一108。它们能以纤维状结构、层状结构或晶体等有序性的型式存在．晶胞的大小或链的周期可从几个-几十甚至几百nm。ProteinCrystallizationandX-raydiffractionX射线衍射技术在蛋白质分析中的应用蛋白质结构测定：1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行了X射线衍射分析，解决了血红蛋白的三维空间结构。血红蛋白的空间结构血红蛋白的X射线衍射图蛋白质三维结构测定根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：（1）应用X射线晶体衍射图谱法（X-raycrystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；（2）应用核磁共振法（nuclearmagneticresonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。X射线衍射技术在蛋白质分析中的应用用X射线衍射晶体结构分析法研究重要生物活性大分子的三维结构、分子识别和作用机理，属于新兴的化学、生物和物理的交叉学科，属于结构生物学领域，是当代生命科学领域内一个分重要的分支，而X射线晶体结构分析是结构生物学最主要的研究手段。研究核糖体失活蛋白（RNAN-糖苷酶）系列，包括天花粉蛋白及其与一系列底物类似物的复合物以及b-苦瓜子蛋白等和甲醇脱氢酶系列：包括从三种不同细菌提取的甲醇脱氢酶，这是我国在国际上首次测定含新型辅基PQQ的酶的三维结构。甲醇脱氢酶H亚基的三维结构飘带图天花粉蛋白-NADPH复合物的结构X射线衍射研究大分子的局限性进行X射线衍射谱的分析，通常高纯度的材料是必须的，首先实验样品应该仔细结晶，去获得高品质的适合X射线衍射研究的晶体。即使可以得到合适的结晶，大分子体系结构的测定仍然比小分子要困难得多。这是因为数目众多的大分子体系结构中的原子结构确定很困难。对仪器要求的复杂性及数据分析都需要消耗大量的计算时间。X射线衍射必须在分子固相中进行，由此获得的结构信息可能就会与分子体系在生物活性状态的情况有所不同。近年来，科学家们努力地发展建立了结晶学软件，大大加快了蛋白质结构测定的步伐。以前需要几周甚至几个月才能完成的工作，现在有可能在几小时到几日内完成。清华大学生命科学研究中心平均每周可以拿到一个新的蛋白质晶体。