藻类基因工程研究进展及展望

学术动态#∆ΕςΕΛΟΠΜΕΝΤ藻类基因工程研究进展及展望Α∆ςΑΝΧΕΣΑΝ∆ΠΡΟΣΠΕΧΤΣΙΝΤΗΕΡΕΣΕΑΡΧΗΟΦΑΛ−ΓΑΛΓΕΝΕ陈颖赵世民孙勇如中国科学院遗传研究所北京α近年来藻类分子遗传学的发展不仅为光合!固氮!渗透调节等基本生命现象和生理过程的机理研究提供了有利手段也为藻类的基因工程奠定了基础∀通过⁄重组技术培育具有高蛋白!低脂肪!耐盐!抗病等优良特性的藻类新品种以及实现藻类天然产物的基因工程生产已成为藻类基因工程研究的两大目标∀原核的蓝藻≤∏因其结构和遗传复杂性同革兰氏阴性菌相似并且有独立的遗传结构)质粒和天然转化与重组系统为开展基因工程研究带来了诸多便利条件∀真核藻类∞∏基因工程起步较晚但已取得了重要突破∀单细胞绿藻莱茵衣藻Χηλαµψδοµονασρεινηαρδιι已成为叶绿体!线粒体与染色体三套基因组均能遗传转化的植物∀红藻质粒的发现为红藻基因工程提供了潜在的载体∀大型藻类基因工程的研究方兴未艾对其遗传转化模式的建立进行了有利探索∀总之藻类基因工程作为生物技术领域中年轻的分支虽刚刚起步但已展现出了十分广阔的发展前景和应用潜力∀质粒及载体系统的研究进展蓝藻自从年发现蓝藻质粒以来已在余株单细胞及丝状蓝藻中证明了质粒的存在大约是被检测藻株的一半∀蓝藻中所含质粒数目∗个不等分子量在∗⁄百万道尔顿之间尽管已检测到一些质粒体内!体外转录和翻译的产物如∏2等已检测到Αναβαενανιδυλανσ的内源质粒°≥编码的⁄的蛋白≥等将铜锈微囊藻Μιχροχψστισαερυγινοσα的内源质粒插入≤中构成载体≤转化Εσ2χηεριχηιαχολι÷发现在其中新合成了两个多肽产物分别为⁄和⁄12但迄今未找到蓝藻质粒编码功能的直接证据∀研究表明不同藻系的不同质粒或同一藻系的不同质粒具有同源序列推测可能含有与细菌质粒相类似的可转移元件并且该序列可能在专一性自养型原核生物的生态学和进化过程中起到一定作用∀迄今构建成功的蓝藻质粒载体都是嵌入细菌遗传标记的重组质粒能在细菌和蓝藻中复制称为穿梭载体≥∏√∀等将带有×Εχολι质粒转座子和的大肠杆菌质粒插入Σψνεχηοχοχχυσ°≤≤内源质粒中第一次获得了带标记的杂种质粒≤及其衍生物≤∀年∏等将≤与≤≠≤融合首次获得了/双向质粒0))穿梭质粒≤和≤能在Εχολι和蓝藻中复制∀此后通过改善载体克隆潜力又相继构建了许多双向质粒如≤!≤!≥!≥!°和≤!÷!÷!±∞!ƒ!ƒ以及在此基础上发展的宿主载体系统ƒ≤∂2Σψνεχηοχψστισ≥ƒ等并大大提高了转化效率∀为检测外源基因的表达又相继构建了检测基因表达的质粒即在穿梭载体中插入报告基因如荧光素酶∏基因氯霉素乙酰转移酶≤×基因Β2半乳糖苷酶≥基因等以酶的活性显示目的基因的表达和确定启动子的作用∀≥等构建了含有∏基因的质粒载体∀中国科学院水生生物研究所徐旭年第期α收稿日期年月日东将安装有≤的≤≥序列的≤×基因重组于穿梭载体≤中利用≤×基因作为报告基因构建了Αναβαενα启动子探测质粒可检测外源和内源启动子的表达≠∀蓝藻中穿梭载体的构建为蓝藻的基因转移奠定了基础∀真核藻类目前已对余种红藻进行了研究结果表明在种红藻中有质粒数目一至多个不等∀等用2≤≤密度梯度离心法从江蓠等红藻中分离到了共价闭合环状≤≤≤型质粒其浮力密度与叶绿体⁄相近且种间分布差异很大∀在红藻Γραχιλαριοπσισλεµανειφορµισ中分离到的两个质粒和之间无同源性与本身及其他种类红藻核!质体及线粒体基因组均无同源性但目前还难以确定这种质粒在细胞中的位置12∀江蓠Γραχιλαριαχηιλενσισ中≤≤两个质粒与核!叶绿体及线粒体⁄之间也无同源性但与Γσορδιδα质粒之间有一定同源性12研究发现≤富含2×并有一个主要的ƒ和两个长的位于个长串联重复区边缘的反向重复区及个短串联重复区∀同时还发现≤具有转录活性12∀在细柱硅藻Χψλινδροτηεχαφυσιφορµισ中定位了两个质粒和的ƒ与的ƒ氨基酸同源性为的ƒ与的ƒ氨基酸同源性为ƒ与×转座子的解体酶氨基酸同源性为∗但这两种质粒均不具转座活性12∀年以来秦松等在一些经济藻类如钝顶螺旋藻!真江蓠中也发现了质粒12∀真核藻类特别是一些经济藻类质粒的发现为真核藻类基因工程提供了潜在的载体对基因工程的改良具有积极意义∀转基因技术的研究蓝藻年≥与首次在Αναχψστισνιδυλανσ中发现了⁄的转化作用∀迄今已发展了两种向蓝藻导入外源基因的方法一种是遗传转化2目前认为能被转化的蓝藻都是无异形胞分化的单细胞藻株∀如Σψνεχηοχοχχυσ°≤≤和Σψνεχηοχψστισ°≤≤等都可在指数生长期有效地吸纳外源⁄而Σψνεχηοχψστισ°≤≤则需用≤诱导人工感受态才能有效地引入外源基因12∀细菌质粒如转化蓝藻的效率很低也需人工诱导感受态∀闵红涛用溶菌酶处理Σψνε2χηοχοχχυσ°≤≤细胞诱导人工感受态并用外源质粒转化受体细胞表达氯霉素抗性转化频率接近≅转化子细胞用转化子⁄再进行次级转化转化频率可达≅转化子细胞∀该方法比以前的研究者对同种藻株!通过生理感受态进行转化得到的转化频率高12∀×等将Σψνε2χηοχοχχυσ的≥≠质粒与Εχολι的≤质粒构成穿梭载体≥≠用电击法转化2≠藻株在≤和甘油处理下获得高频转化子12∀×等用电击法转化丝状蓝藻Αναβαενα用穿梭载体在高场强!短间隙处理下获得了高的转化频率并发现限制性内切酶酶切位点对转化频率的高低具有显著影响同一质粒中同一位点修饰比未被修饰的转化率低倍∀第二种转基因方法是接合转移≤∏∀它是丝状蓝藻基因转化的有效系统但需先构建含有目的基因!Εχολι质粒复制起点及转移起点×和选择标记的杂交质粒转化含有辅助质粒有识别×的基因的Εχολι菌株再通过接合引入一个接合质粒具有编码接合装置的基因使种质粒位于同一宿主然后与受体藻株混合通过抗生素筛选获得抗性藻落∀辅助质粒!接合质粒由于无法复制或整合而逐渐丢失12∀该方法类似于农杆菌介导的三亲交配法∀•等首先建立了Αναβαενα等的接合转移系统该系统由接合质粒°2辅助质粒有识别位点的基因及系双向质粒构成∀•等用从Σψνεχηοψστισ°≤≤中分离的δεσ脂肪酸脱饱和酶基因转化其野生型和突变株并得到表达12∀目前已将芽孢杆菌的杀幼蚊毒基因小鼠的金属硫蛋白2的⁄12以及来自人的超氧化物歧化酶≥⁄基因在蓝藻中得到了表达∀同时蓝藻中的一些基因也已在细菌!真菌中得到了表达如与光合作用有关的藻蓝蛋白!∏基因及一些与固氮作用!氨基酸合成有关的基因∀中国科学院海洋研究所秦松等正与日本国立研究院合作进行螺旋藻和海带基因工程的研究期望用大型藻类作为廉价高效生物反应器来表达从钝顶螺旋藻中克隆的别藻蓝蛋白基因∀目前转化方法!再生途径!选择标记都已找到12并申请了专利申请号∀海洋科学≠徐旭东博士学位论文中国科学院水生生物研究所∀单细胞绿藻衣藻是单倍体绿藻突变型较多因此是分子遗传学和基因工程研究的理想材料∀年¬用携带有酵母位点和复制起点的酵母质粒成功地转化了一个缺壁嗜精氨酸具位点突变的藻株得到了能在不加精氨酸的培养基上生长的转化藻株但转化频率很低12∀∏用≥∂启动子°基因产生对!及的抗性和Λ长的酵母复制起点作为异源复制子构成≥∂Λ质粒转化缺壁的衣藻突变体得到了抗新霉素类似物2的转化藻株12∀等等连续报道了该小组用基因枪轰击技术把带有野生型叶绿体⁄片段导入距细胞膜很近的莱茵衣藻杯状叶绿体中使发生删除突变的叶绿体基因组恢复原长度和功能12∀莱茵衣藻目前已成为唯一的染色体!叶绿体和线粒体三套基因组均能遗传转化的植物12∀染色体转化最为有效!最简便的方法为玻璃珠研磨法12但必须选用细胞壁缺失突变株或选用配子自溶素∏消化去壁∀由于莱茵衣藻密码子使用的偏向性使得外源基因在其中的表达效率不高因此以内源基因做为转化后的筛选标记则是有效且可靠的方法∀如用从野生型中克隆的基因转化突变株通过营养缺陷!光合作用缺陷等进行筛选∀和利用玻璃珠研磨法将莱茵衣藻野生型中硝酸还原酶基因转入到含有2的突变藻株中以硝酸为唯一氮源进行筛选获得了转化体∏⁄的高频转化率12∀等采用玻璃珠研磨法将含有°×2和≥启动子的转化莱茵衣藻硝酸还原酶突变株用双选择标记筛选硝酸盐筛选的转化子中对卡那霉素具有抗性12∀和将莱茵衣藻中的∞∞基因利用基因枪法导入∞∞缺失突变株中获得了能进行光合作用并能够在乙酸缺失条件下生长的藻株∀进一步的杂交分析表明转化体光合能力的恢复并不是由于突变基因的恢复而是由于外源基因的表达12∀√等进行了荧火虫荧光素酶基因在绿藻椭圆小球藻Χηλορελλαελλιποσιδεα中的瞬间表达实验∀将装有≤∂≥启动子的质粒⁄转化小球藻原生质体后即可检测到荧光素酶的合成时酶活性最高后逐渐丧失12∀目前单细胞藻类转化还可以用≥∂及小鼠金属硫蛋白启动子∀大型藻类近年来大型藻类基因工程也取得了进展≤2等发现≤∂≥和≥启动子能驱动≥基因在红藻Ευχηευµα瞬间表达12王素娟报道了用电击法将≥基因导入红藻坛紫菜原生质体中获得瞬间表达12∏等也采用电击法将≥基因导入红藻紫菜Πορπηψραµινιατα的原生质体中并实现了瞬间表达12∀但对于原生质体再生较困难的藻类则需选择合适的转化受体以提高转化效率和再生频率∀不同的受体由于其组织的物理特性!细胞生理状态等方面的不同对外源基因吸纳程度也就不同∀秦松等将质粒分别导入海带和裙带菜的叶状体中部叶片!假根及中肋部叶片后只在海带假根细胞和裙带菜中肋部叶片细胞中检测到≥基因的表达而海带叶片不论轰击一次还是两次外观或解剖观察均无显色反应在裙带菜假根中也未发现转化细胞通过12∀转化海带孢子体和配子体发现雌配子体是较理想的转化受体孢子体由于整体抗性大一些未转化细胞与转化细胞不容易分开而产生嵌合体从而影响外源基因的表达水平∀而由雌配子体通过孤雌生殖产生的再生孢子体遗传性状均一产生嵌合体的机率则大大降低≠12∀大型藻类基因工程中亟待解决的问题是选择有效的转基因手段和可利用的基因工程原件∀基因枪作为一种转基因手段因其转化效率高!转化受体类型广泛等特点被认为是大型藻类特别是原生质体再生困难的藻类基因转化的有效途径∀目前已通过此方法将≤×!等外源基因转入到褐藻海带并得到表达12∀研究表明目前高等植物基因工程研究中使用最多的启动子≤∂≥能被大型藻类的转录系统识别可做为藻类基因工程的启动元件1∗2≠此外≥∂和≥启动子分别使≤×和≥基因在海带和红藻麒麟菜中获得瞬间表达12≠而≤启动子则获得阴性结果12∀大型藻类遗传转化没有现成的选择标记∀目前发现海带!裙带菜对高等植物遗传转化中常用的卡那霉素!新霉素等选择性试剂不敏感而对氯霉素敏感12∀展望藻类基因工程以藻类分子遗传学研究为基础借鉴陆地植物和微生物基因工程中的成功经验近几年年第期≠武建秋!秦松!王希华!曾呈奎∀≤×基因导入海带幼孢子体后的表达海洋与湖沼待刊∀发展十分迅速特别是海带!紫菜!螺旋藻等经济藻类的基因工程研究对培育优质!高产新品种发展海洋药物都具有十分重要的意义∀由于藻类具有繁殖迅速!再生快!体积相对较小!结构简单等特点通过基因操作以藻类为廉价的生物反应器来生产有用产品特别是来源紧俏造价昂贵的药物具有潜在的应用前景∀近年来在哺乳动物的特异细胞如巨噬细胞!嗜中性白血细胞或小肠潘氏细胞中发现了一类新的具微生物抗性的多肽类物质它对细菌!分枝杆菌!螺旋体!真菌和被膜病毒有广谱的毒杀效应人们称这一类多肽为防御素∀由于微生物对其难以产生抗性在医药上具有广阔的应用前景∀但从哺乳动物的细胞中提取防御素价格极其昂贵成本很高从而影响了其在医药上的应用∀为解决这一问题目前我们正开展小球藻基因工程的研究期望用单细胞绿藻))小球藻作为生物反应器以大量提取防御素基因的表达产物使防御素的医药用途得以实现∀我国的藻类资源十分丰富共有经济海藻种其中蓝藻种!红藻种!褐藻种我国的海藻生物技术研究在短短的十几年里从无到有并取得了较大的进展开发海洋资源的巨大潜力正在为越来越多的人们所认识∀随着藻类分子遗传学和基因工程研究的进一步深入通过生