草莓品种‘晶玉’高效离体再生体系的建立

1草莓品种‘晶玉’高效离体再生体系的建立向发云，韩永超，曾祥国，顾玉成*(湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉430064)摘要：本文以草莓‘晶玉’为试材，研究了不同植物生长调节剂浓度和配比对叶片、叶柄再生的影响，不同暗培养时间对叶片再生的影响，并筛选出了最佳的生根培养基，建立了草莓‘晶玉’的高效离体再生体系。结果表明，MS+TDZ2.0mg•L-1+2,4-D0.05mg•L-1最利于‘晶玉’草莓叶片不定芽的分化，不定芽再生率可达81.45%，每叶块平均再生芽数达到了4.47个；暗培养7天有利于叶片不定芽的再生。而MS+TDZ3.0mg•L-1+2,4-D0.05mg•L-1组合对‘晶玉’叶柄不定芽再生最好。‘晶玉’草莓的最佳生根培养基为1/2MS+0.05mg•L-1NAA+0.05mg•L-1IBA。关键词：草莓；离体再生；叶片；叶柄EstablishmentofHighEfficientRegenerationSystemofStrawberryVariety‘Jingyu’XiangFa-yun,HanYong-chao,ZengXiang-guo,GuYu-cheng*(IndustrialCropsInstituteofHubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430064,China)Abstract：Inthispaper,wehavestudiedtheeffectsofplantgrowthregulatorsanddarkincubationintheinducingadventitiousshootofstrawberryvariety‘Jingyu’.Weestablishedhighefficientplantregenerationsystemof‘Jingyu’strawberry.Theresultsshowedthattheoptimumbuddifferentiationmediumoftheleavesfrom‘Jingyu’wasMSsupplementedwith2.0mg•L-1TDZand0.05mg•L-12,4-D.Theadventitiousbuddifferentiationratewas81.45%andtheaverageregenerationbudnumberwas4.47perleafdiscs.For'Jingyu'leaves,7daysdarktreatmentincreasedtherateofadventitiousshootregeneration.For‘Jingyu’petioles,adventitiousshootregeneratedbestonMSsupplementedwith3.0mg•L-1TDZand0.05mg•L-12,4-D.Thebestrootingmediumof‘Jingyu’strawberrywas1/2MSsupplementedwith0.05mg•L-1NAAand0.05mg•L-1IBA.Keywords:strawberry,invitroregeneration,leaf,petiole‘晶玉’是湖北省农业科学院经济作物研究所以‘甜查理’为母本，‘晶瑶’为父本杂交选育的草莓新品种，于2012年通过湖北省农作物品种审定委员会的审定[1]。该品种具有品质较优、抗炭疽病和白粉病、丰产性好等优势，是生产上很有潜力的一个栽培品种。建立其高效的再生体系，对于草莓品种的种质交换及进一步的草莓遗传转化研究具有重要意义[2-3]。国内外对草莓的组织培养再生研究已有一些报道，主要集中在对草莓茎尖快速繁殖，不同品种的叶片、叶柄、花药不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相关研究中涉及的品种主基金项目：国家农业科技成果转化项目（2012GB2D100298），湖北省农业科技创新中心资助项目（2007－620－001－03），武汉市青年科技晨光计划项目（201150431127）作者简介：向发云（1978－），男，湖北公安人，助理研究员，硕士，（电话）13407189629（电子信箱）[e-mail]；通讯作者，顾玉成（电子信箱）[e-mail]。2要是丰香、全明星、红颊、晶瑶、图德拉等[7-9]，但具有高效再生体系的优良草莓品种仍然较少，有必要进一步对新审定的草莓品种进行高效再生体系研究。本研究以‘晶玉’叶片、叶柄为试材，研究了不同激素浓度和配比对叶片、叶柄不定芽分化的影响，暗处理对不定芽分化的影响等，建立了高效的‘晶玉’草莓离体再生体系。1材料与方法1.1供试材料‘晶玉’草莓，种植于湖北省农业科学院经济作物研究所草莓试验圃，自田间选取健壮草莓母株上生长充实而小叶尚未展开的匍匐茎顶端约3cm-4cm长的顶芽。1.2无菌材料的获得对匍匐茎顶芽先用自来水将组织器官冲洗干净并擦干，转入超净工作台，按下列程序消毒。用70%的酒精浸润30秒左右，无菌水冲洗一次，然后用0.1%HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗5次。将处理好的顶芽在无菌纸上逐层剥去幼叶取出茎尖生长点，接于MS培养基上生长。茎尖在MS培养基上成活后，在MS+0.5mg•L-1BA+0.05mg•L-1NAA上继代一次，以25天苗龄无菌试管苗的叶片、叶柄为试验材料。1.3不同浓度的6-BA与IAA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响取长势健壮、三出复叶均展开的的‘晶玉’无菌试管苗叶片，去除叶片边缘部分，切成5x5mm2左右的小块状叶盘，以近轴面向下与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+Sucrose30g•L-1+Phytagel2.5g•L-1、pH5.8为基本培养基，分别添加1mg•L-1、2mg•L-1、3mg•L-1的6-BA与0.1mg•L-1、0.3mg•L-1、0.5mg•L-1的IAA激素配比，50d后进行观察统计，研究不同浓度的6-BA与IAA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响。每个处理80个叶片，每处理重复3次。接种后培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500-2000Lx、光照时间16h/d（除暗培养外，下同）。1.4不同浓度的TDZ与2，4-D组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响同1.3的接种培养方法，以MS+Sucrose30g•L-1+Phytagel2.5g•L-1、pH5.8为基本培养基，分别添加1mg•L-1、2mg•L-1、3mg•L-1的TDZ与0.05mg•L-1、0.1mg•L-1、0.2mg•L-1的2，4-D激素配比，50d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与2，4-D组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响。1.5不同浓度的TDZ与IBA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响同1.3的接种培养方法，以MS+Sucrose30g•L-1+Phytagel2.5g•L-1、pH5.8为基本培养基，分别添加1mg•L-1、2mg•L-1、3mg•L-1的TDZ与0.1mg•L-1、0.3mg•L-1、0.5mg•L-1的IBA激素配比，50d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与IBA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响。1.6不同暗培养时间对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响以MS+TDZ2mg•L-1+2，4-D0.05mg•L-1+Sucrose30g•L-1+Phytagel2.5g•L-1、pH5.8为培养基，叶盘接种后分别进行25±2℃下0d、7d、14d、21d、28d的暗处理后，3再置于光照强度1500-2000Lx、光照时间16h/d的光条件下培养，研究不同暗培养时间对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响。每个处理80个叶片，每处理重复3次。1.7不同浓度激素配比对‘晶玉’草莓叶柄不定芽再生的影响取长势健壮、三出复叶均展开的‘晶玉’无菌试管苗叶柄，切成1cm左右的小段与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+Sucrose30g•L-1+Phytagel2.5g•L-1、pH5.8为基本培养基，分别添加不同浓度的TDZ与2，4-D或IBA的配比，50d后进行统计，研究不同浓度激素配比对‘晶玉’草莓叶柄不定芽再生的影响。每个处理80个叶柄切段，每处理重复3次。接种后培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500-2000Lx、光照时间16h/d。1.8再生小苗生长与植株生根将再生的‘晶玉’草莓不定芽在MS+0.5mg•L-1BA+0.05mg•L-1NAA上继代一次，当不定芽长至3cm左右时，将生长健壮的无根小苗在超净工作台上，接种于不同生根培养基上进行生根培养，25d后进行观察统计。通过生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗等指标综合衡量‘晶玉’草莓的最佳生根培养基。1.9试验结果观察与数据统计在不定芽再生过程中，持续观察外植体形态变化及不定芽再生情况。培养50d后，统计不同处理不定芽再生频率和每个外植体再生的不定芽个数，计算不定芽再生率及每外植体再生芽数。计算公式如下：不定芽再生频率(%)=再生出不定芽的外植体数/接种的外植体总数×100%；每外植体再生芽数=外植体再生出的不定芽总数/再生出不定芽的外植体数×100%。试验数据采用Excel2003软件进行分析，应用SAS８.0软件进行差异显著性（Ｐ＜0.05）分析。2结果与分析2.1不同浓度的6-BA与IAA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响表1不同浓度的6-BA与IAA配比对叶盘再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数A16-BA1.0+IAA0.10.00±0.00g0.00±0.00fA26-BA1.0+IAA0.32.05±0.89fg1.58±0.16deA36-BA1.0+IAA0.56.82±0.38de2.06±0.19bcA46-BA2.0+IAA0.14.46±0.41ef1.56±0.18deA56-BA2.0+IAA0.315.17±0.87b2.25±0.27bA66-BA2.0+IAA0.519.05±1.25a2.69±0.11aA76-BA3.0+IAA0.15.31±0.21de1.44±0.27eA86-BA3.0+IAA0.311.94±2.20c1.90±0.08bcdA96-BA3.0+IAA0.58.14±2.98d1.76±0.06cde注：不同字母表示不同处理间差异显著，P＜0.05。下表同。4‘晶玉’叶盘接种于添加了6-BA与IAA不同浓度组合的再生培养基上，愈伤产生量少,且愈伤多为浅绿色、质地较致密坚硬，30d左右不定芽开始分化形成。大部分不定芽经愈伤组织分化形成，少量不定芽直接在叶片切口末端形成。如表1所示，不同浓度的6-BA与IAA组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的试验中，该组合总体上能够诱导叶片不定芽的再生，但再生频率较低。其中2.0mg•L-16-BA+0.5mg•L-1IAA的组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生相对较好，再生率达到了19.05%，与其它处理水平差异显著。2.2不同浓度的TDZ与2，4-D组合对‘晶玉’草莓叶片不定芽再生的影响表2TDZ与2,4-D对叶盘不定芽再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数B1TDZ1.0+2,4-D0.0513.51±0.56g2.94±0.06efB2TDZ1.0+2,4-D0.14.00±0.63h2.71±0.17fB3TDZ1.0+2,4-D0.20.00±0.00i0.00±0.00gB4TDZ2.0+2,4-D0.0581.45±1.08a4.47±0.30aB5TDZ2.0+2,4-D0.136.38±1.43d3.93±0.05bB6TDZ2.0+2,4-D0.222.52±1.16f3.18±0.09deB7TDZ3.0+2,4-D0.0575.37±1.05b3.83±0.11bcB8TDZ3.0+2,4-D0.146.98±0.83c3.47±0.11cdB9TDZ3.0+2,4-D0.225.23±0