药用真菌双向性固体发酵对雷公藤减毒持效的研究

期刊文献药用真菌双向性固体发酵对雷公藤减毒持效的研究庄毅，苏明声，谢小梅﹡﹡（江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室菌物药研究中心，江西南昌330004）[摘要]目的：研究双向固体发酵后雷公藤菌质的急性毒性，对小鼠免疫功能、抑瘤作用和抗炎镇痛的作用。方法：以改进寇氏法测定发酵后不同时间雷公藤菌质的LD50。以各雷公藤菌质的LD50的1/6量给小鼠连续灌胃7天后脱颈处死，取脾细胞培养，分别用ConA、LPS刺激，MTT法检测T/B淋巴细胞的增殖情况。采用小鼠肉瘤(S180)移植性肿瘤模型，观察灵雷菌质乙酸乙酯、正丁醇、石油醚和水提取物的肿瘤抑制作用。通过二甲苯致耳肿胀法观察灵雷菌质的抗炎作用；采用热板法观察灵雷菌质的镇痛作用。结果：雷公藤菌质的急性毒性较雷公藤生药明显降低，发酵雷公藤菌质能显著抑制小鼠T、B淋巴细胞的增殖。雷公藤菌质所有的提取物都呈现出明显的抑瘤效果，抑瘤率均大于35%，其中正丁醇部分的抑瘤率达到了68.88%。雷公藤菌质对二甲苯所致小鼠耳肿胀有良好的抑制作用并能升高致痛小鼠的痛阈。结论：运用双向固体发酵技术可以降低雷公藤毒性并保持其有效的药理活性。关键词：双向固体发酵；雷公藤菌质；LD50；免疫功能；抑瘤作用；抗炎镇痛Studiesoftoxicity-reducingandefficacy-maintainingactionoffungalfermentativeproductsinTripterygiumwilfordiibyanovelbi-directionalsolid-statefungalfermentationZhuangYi,SuMingsheng,XieXiaomei(1.(JiangXiUniversityofTradionalChineseMedicine,KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MycomedicineResearchCenter,JiangxiNanchang330004)[Abstract]OBJECTIVE:Tostudyofthetoxicity,theeffectonimmunity,anti-tumor,anti-inflammatoryandanalgesicoffungalfermentativeproductsinTripterygiumwilfordiiHook(TWFFP)byanovelbi-directionalsolid-statefermentation.METHODS:ToxicityofTWFFPwaswithLD50,thenmiceweretakenthedurgsbasedonone-sixthofLD50for7daysandkilled,spleencallswascultured,andthemethodofMTTwasusedtodetectthesituationofproliferationbothTandBlymphocytes.MicebearingtransplantedtumorS180wasusedtosurveytheanti-tumor’s基金项目：科技部国际合作项目（与美国马里兰大学）“雷公藤固体发酵减毒持效的研究”，No2006DFA33060；江西省科技攻关项目“‘减毒持效’的雷公藤菌质新药材开发研究”；南昌市科技局攻关项目“‘减毒持效’的雷公藤菌质新药材开发研究”﹡﹡通讯作者：0791-7118707，email：[e-mail]期刊文献effectofextractiveTWFFP,suchasethylacetatepart,n-butylalcoholpart,petroleunetherandwaterpater.Andthemice’sthymusindexandspleenindexhadbeenmeasured.Modelofacuteinflammatoryreactionsofxylene-inducedmouseearedemawasperformedtostudytheanti-inflammatoryeffects,andhotplatetestinmicewereusedtostudytheanalgesiceffect.RESULT:ToxicityofTWFFPwassharplylowerthantherawmaterials,andTWFFPhadtheinhabitingeffectonproliferationbothTandBlymphocytes.Allextractiveappearedsignificanttumorresistance,itsresistingrateallabove35%,especiallyn-butylalcoholpart’santi-rateis68.88.TWFFPsignificantlysuppressedxylene-inducedmouseearedemaandpainthresholdwasremarkablyimproved.CONCLUSIONToxicityofTWFFPcouldbereducedbybi-directionsolidfermentationandtheeffectofimmunosuppression,anti-tumoranti-inflammatoryandanalgesicweremaintaining.KEYWORD:bi-directionsolid-statefermentation;fungalfermentiveproductsinTripterygiumwilfordiiHook;LD50;immunityfunction;anti-tumor;anti-inflammatory;analgesic雷公藤为卫茅科植物雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.F.）的全株，又名黄藤根、断肠草、山砒霜。其性凉味辛，有大毒，主要分布在我国长江中下游地区。始载于《神农本草经》，清代赵学敏《本草纲目拾遗》记载:“出江西者力大，土人采之毒鱼，凡蚌螺之类亦死，其性最烈”[1]对雷公藤药理作用的研究表明，雷公藤具有免疫抑制、抗炎、抗菌、抗病毒（HIV病毒）、抗肿瘤、抗生育等作用。目前雷公藤及其制剂在临床上已应用于类风湿性关节炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮、器官移植排斥反应、肿瘤等50多种疾病，尤其用于治疗自身免疫性疾病，是目前中药中最强的免疫抑制剂，但它的毒副反应严重且发生率高，雷公藤几乎成为近半个世纪以来报道发生中毒事件最多的中草药之一，大大限制其临床应用。雷公藤减毒持效研究已成为国内外学者关注的焦点。目前对雷公藤进行减毒持效的方法是将其毒性最强的根皮去除、控制煎煮时间、改变剂型、改变给药途径、多种治疗手段结合、单味中药或复方配伍应用以及通过活性单体生物转化技术进行结构改造等。虽然这些方法能够控制雷公藤的毒性，但效果都不太理想，不能从根本上降低雷公藤生药的急性毒性并保持药效。本研究采用双向固体发酵法获得不同发酵时间的雷公藤菌质，对其急性毒性、免疫作用、抑瘤作用和抗炎镇痛作用分别进行了研究。1材料与方法1.1实验动物昆明种小鼠，体重18-22g，由江西中医学院实验动物中心提供。1.2药品与试剂期刊文献雷公藤菌质浸膏(分别发酵30天、35天及40天的菌质提取物，即G30、G35及G40，由本实验室提供)；地塞米松片剂(浙江仙据制药股份有限公司)；RMI-1640培养基(Gibco公司)；LPS、ConA及MTT(Sigma公司)；DMSO(分析纯，天津福晨化学试剂厂)。1.3雷公藤菌质LD50的测定[2]根据改进寇氏法，将小鼠随机分组，每组10只，根据预实验测得的剂量范围进行正式实验，按照小鼠体重每10g灌胃0.4m1给药1次，即刻及连续观察7天之内的动物反应情况，记录死亡数，计算G30、G35及G40及雷公藤生药的LD50。1.4雷公藤菌质对小鼠免疫功能的影响1.4.1分组取小鼠30只，雌雄各半，随机分成5组:蒸馏水组、地塞米松组、G30组、G35组和G40组。1.4.2给药方法根据小鼠体重按每10g灌胃0.2m1计算给药量，地塞米松组浓度为0.375mg/ml，雷公藤菌质组按LD50的I/6量，蒸馏水组按体重给予等量蒸馏水，连续7天给药。1.4.3MTT法测定脾淋巴细胞增殖小鼠给药7天后脱颈处死，无菌条件下摘取脾脏，制备成2x106/ml浓度的脾细胞悬液(经台盼蓝染色，活力≥95%)，在96孔板上每孔加100μl细胞悬液，分别加入ConA10μg/ml)和LPS(20μg/ml)各100μ1。每个样品设3个重复孔。置37℃、5%CO2培养箱培养48h后，每孔加入10μ1MTT(5mg/ml),37℃孵育4h，离心，1000rpm,10min，弃上清，再每孔加人150μ1二甲基亚矾(DMSO)振荡。在自动酶标仪测OD值(λ=492nm)。实验结果以sx表示，采用SPSS11.5独立样本t检验进行处理。1.5抑瘤实验无菌抽取8d龄S180荷瘤小鼠腹腔瘤细胞液，以不完全培养液洗2次，用完全培养液调整成1×107个/mL的细胞悬液，备用。取雄性昆明种小鼠，在右腋下接种瘤细胞悬液0.2ml。通过预实验摸索出雷公藤菌质提取物的安全有效剂量。正式实验随机分组，每组10只，分别为雷公藤菌质乙酸乙酯部位组，雷公藤菌质正丁醇部位组，雷公藤菌质石油醚部位组(给药浓度分别为：0.0891g/ml，0.1018g/ml，0.1425g/ml)，雷公藤菌质水部位组40mg/ml，环磷酰胺组5mg/ml(阳性对照组)，和蒸馏水组(空白对照组)；以及雷公藤生药的石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位和水部位，给药浓度参照雷公藤菌质提取物。接种瘤液24h后，口服灌胃给药，给药剂量为小鼠体重×0.02ml，连续给药7d后处死小鼠，取肿瘤组织称重[3]。期刊文献1.6抗炎镇痛1.6.1对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响[7]取昆明种雄性小鼠60只（18~22g），随机分为6组，每组10只，分别为雷公藤生药组、G30高、中、低剂量组、地塞米松（阳性）组、生理盐水（NS）组即空白组。根据小鼠体重按每10g灌胃0.2ml计算给药量，G30高、中、低的浓度分别为其LD50的1/8、1/12、1/16，地塞米松的浓度为3.75mg/kg，空白组按体重灌服等量生理盐水。连续灌胃给药4d。末次给药后1小时，用移液枪在小鼠左耳涂抹二甲苯正反两面各10μl。30min后，将小鼠颈椎脱臼致死，沿耳廓基线剪下两耳。用6mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，电子天秤称重。计算肿胀抑制率。肿胀抑制率（%）=（A﹣B）／A×100%式中，A代表空白组肿胀度，B代表受试药物组或阳性对照药物组肿胀度。肿胀度=左耳重量-右耳重量1.6.2热板法镇痛试验[4]将雌性小鼠置于(55.4±0.5)度恒温热板上，以舔后足为指标，筛选痛阈值大于5s小于30s的合格小鼠60只。将筛选的合格小鼠随机分为6组，分别为空白组、G303个剂量组(即G30高，G30中，G30低)、阿司匹林组（0.2g/kg）、雷公藤生药组。各组按0.2ml/10g体重ig给药，空白组给予同等剂量的生理盐水，连续4d。第4天给药后15、60、90、120、180min依次测量各小鼠痛阈值，并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率=[（用药后平均痛阈-用药前平均痛阈）/用药前平均痛阈值]*100%2结果2.1雷公藤菌质LD50G30的LD50为28.46g/kg,G35的LD50为19.13g/kg,G40的LD50为16.12g/kg,雷公藤生药的LD50为1.2g/kg，可见雷公藤菌质的毒性较生药有明显降低，尤以3G30组毒性最低。2.2对小鼠T,B淋巴细胞增殖功能的影响以地塞米松为阳性对照，MTT法检测小鼠T,B淋巴细胞增殖情况。与蒸馏水组比较，G30组、G35组对T,B淋巴细胞的增殖均降低，且差异有显