菜花DNA的提取

菜花中DNA的提取一.实验原理1．核酸分离提取的原则1）应保证核酸一级结构的完整性2）排除其他分子的污染A．核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子B．其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度排除其他核酸分子的污染（如：提取DNA分子应除去RNA；反之亦然）2.核酸提取的步骤1）破碎细胞（材料不同，方法不同）匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。2）除杂质，提DNA杂质：蛋白，多糖，脂类，DNase,RNaseA.DNase的抑制DNase需Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加0.01MEDTA或EDTA钠盐。（螯合金属离子）加去垢剂或变性剂（SDS），可使DNase变性失活B.除RNA酶法：加RNase调节pH：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定（核酸的理化性质），所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。调节盐浓度(盐的分步沉淀)：在浓NaCl（1－2M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。C.除蛋白加去垢剂或变性剂（SDS，十二烷基硫酸锂LDS，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNA分开；用有机溶剂沉淀，除去蛋白常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚，8－羟喹咛，间甲酚等本次实验所用：氯仿：异戊醇＝24：1氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。D.除糖，脂类对于含糖量高，含脂高的样品需要做加蛋白水解酶：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶K二.利用盐不同浓度提取DNA1.实验试剂和器材1）材料菜花2）实验试剂5mol/LNaCl溶液;0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液;25%SDS溶液；24:1氯仿－异戊醇混合液；乙醇；3）实验器材•研钵•离心管:10ml指管•移液管，•高速离心机•水浴锅三.实验步骤1.取菜花4g，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊状。2.分次加入10ml0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液，将糊状物转入两个10ml的离心管中。6000r/min离心10min，弃去上清。（注：做鸡肝的可再加7ml/管0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液，将沉淀搅匀后6000r/min离心8min，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。3.向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液2ml/管，25％SDS溶液0.25ml/管,搅拌至混匀。置60℃水浴保温10min，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。4.加入5mol/LNaCl溶液1ml/管，搅拌混匀，加入约一倍体积的氯仿－异戊醇混合物（约4ml/管），颠倒混匀5－10min。6000r/min离心10min。5.吸出上清至洗净的烧杯中，加入2倍体积的预冷95%乙醇，放置2-3分钟，DNA沉淀析出，用玻棒慢慢搅动，可将DNA丝状物缠在玻棒上。6.将沉淀转入eppendorf管中,用无水乙醇洗涤一次,自然干燥,4℃保存备检测.四.实验结果分析讨论•写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的。•查阅相关资料，写出至少一种其它方法提取DNA的原理及步骤五.琼脂糖凝胶法检测DNA核酸检测方法紫外吸收法有机试剂法琼脂糖凝胶电泳法提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱未除去RNA的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱