第六章电化学分离法

第六章电化学分离法Electrochemicalseparation第一节电泳分离法第二节化学修饰电极分离法§6－1电泳分离法一、电泳分离法的原理二、电泳分离法的分类三、高效毛细管电泳四、电泳分离法的应用一、电泳分离法的原理在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。一、电泳分离法的原理1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；一、电泳分离法的原理当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηr；r—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)一、电泳分离法的原理所以，迁移速度：ErqfqEπ6（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度（迁移率）μ：单位电场强度下的平均电泳速度。rqEπ6（6－1）一、电泳分离法的原理另外，根据离子迁移率的定义，μ也可以写成：tVLsV/Ls/tEυμ式中，V是外加电压，L是两电极间的距离，t是电泳的时间，s是带电质点在时间t内迁移的距离。LVtΔμΔs根据上式，两种粒子迁移距离之差为：（6－3）（6－2）一、电泳分离法的原理影响带电粒子分离程度的因素1）带电粒子迁移率（淌度）根据（6－3）式，两种粒子的淌度差越大，分离越好。而根据（6－1）式可知：带电粒子的淌度与电荷成正比，与离子半径成反比。所以，电荷与半径相差越大，越容易用电泳法分离。一、电泳分离法的原理2）电解质溶液的组成据（6－1）式，溶液组成不同，粘度不同，导致迁移率不同。另外，电解质组成不同，有时会改变测定物的电荷及半径，从而导致迁移率不同。一、电泳分离法的原理3）外加电位梯度电位梯度是指每厘米的平均电位降，即V/L，当L一定时，加在两电极间的电压越高，分离所需的时间越短，分离越完全。对于分离性质相近的元素，多半使用高压电泳，其电位梯度达100V/cm以上,但高电场会产生焦耳热，使柱效降低。一、电泳分离法的原理4）电泳时间电泳时间越长，离子分离越完全。但分离性质相似的元素，单靠增加电泳时间收效不大。二、电泳分离法的分类电泳分为前流型和区带型。前流型是指无支持体的溶液自由进行的，而区带型是指在一个支持体上进行的电泳。后者应用最广。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳（即前流型）、毛细管等；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。三、高效毛细管电泳1.高效毛细管电泳的发展与特点2.高效毛细管电泳的基本理论3.高效毛细管电泳的仪器4.高效毛细管电泳的分离模式1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达4×105/m理论塔板数，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。1.高效毛细管电泳的发展与特点高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了20-75μm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。1.高效毛细管电泳的特点1）仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2）分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；1.高效毛细管电泳的特点3）操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4）应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；2.高效毛细管电泳的基本理论1）电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。2.高效毛细管电泳的基本理论当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。2.高效毛细管电泳的基本理论石英毛细管，柱内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。2.高效毛细管电泳的基本理论电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μ=ε0εζ/ηε0—真空介电常数；ε—介电常数；ζ—毛细管壁的Zeta电势。ν电渗流=ε0εζE/η2）HPCE中电渗流的大小2.高效毛细管电泳的基本理论实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。2.高效毛细管电泳的基本理论电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；3）HPCE中电渗流的方向2.高效毛细管电泳的基本理论改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。2.高效毛细管电泳的基本理论4）HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。2.高效毛细管电泳的基本理论5）HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。电渗在电泳分离中扮演着重要角色，是伴随电泳产生的一种电动现象。多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7倍。因此，在HPCE中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次HPCE操作中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和方向可以影响HPCE分离的效率、选择性和分离度，所以成为优化分离条件的重要参数。电渗流的细小变化将严重影响HPCE分离的重现性（迁移时间和峰面积）。所以，电渗流的控制是HPCE中的一项重要任务。2.高效毛细管电泳的基本理论6）HPCE中影响电渗流的因素i）电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。ii）毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；2.高效毛细管电泳的基本理论iii）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethene，一般称作“不粘涂层”；是一种使用了氟取代聚乙烯中所有氢原子的人工合成高分子材料。这种材料具有抗酸抗碱、抗各种有机溶剂的特点，几乎不溶于所有的溶剂。同时，聚四氟乙烯具有耐高温的特点，它的摩擦系数极低，所以可作润滑作用之余，亦成为了水管内层的理想涂料。2.高效毛细管电泳的基本理论ⅳ）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。2.高效毛细管电泳的基本理论毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；ⅴ）温度的影响2.高效毛细管电泳的基本理论ⅵ）添加剂的影响加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；如：加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。2.高效毛细管电泳的基本理论3.高效毛细管电泳的仪器3.高效毛细管电泳的仪器3.高效毛细管电泳的仪器3.高效毛细管电泳的仪器•电压：0～30kV；•分离柱不涂敷任何固定液；•紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）3.高效毛细管电泳的仪器1）高压电源0～30kV稳定、连续可调的直流电源；具有恒压、恒流、恒功率输出；电场强度程序控制系统；电压稳定性：0.1%；电源极性易转换；2）毛细管柱材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度=1m3.高效毛细管电泳的仪器3）缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；4）检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-14～10-16离子灵敏，需专用的装置4.高效毛细管电泳的分离模式八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同；4.高效毛细管电泳的分离模式1）毛细管区带电泳（CZE）带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；4.高效毛细管电泳的分离模式阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；4.高效毛细管电泳的分离模式2）毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。4.高效毛细管电泳的分离模式特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。4.高效毛细管电泳的分离模式3）胶束电动毛细管色谱（MECC）ⅰ）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。ⅱ）电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；4.高效毛细管电泳的分离模式ⅲ）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；ⅳ）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；ⅴ）色谱与电泳分离模式的结合。4.高效毛细管电泳的分