第六章真核生物的遗传分析最新.

6.1真核生物基因组（了解）6.2真菌类的四分子分析与作图（重点掌握）6.3真核生物重组的分子机制6.4基因转变及其分子机制（了解）6.5体细胞交换与基因定位（自学了解）6.6体细胞融合与基因定位（自学了解）6.7真核生物基因的删除、扩增及重排（了解）第六章真核生物的遗传分析6.1真核生物基因组6.1.1C值悖理6.1.2N值悖理6.1.3真核生物基因组DNA序列的复杂度基因组（genome）：一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因。基因组DNA测序的结果表明基因组中不仅包含着整套基因的编码序列，同时还包含着大量非编码序列，即基因之间的序列。这些序列同样包含着遗传指令(geneticinstruction)。因此，基因组是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。6.1.1C值悖理(Cvalueparadox)C值（Cvalue）：一个物种基因组的DNA含量是相对恒定的，它称为该物种的C值，即单倍体所含DNA总量。每种生物各有其相对恒定的C值不同物种的C值之间有很大差别能营独立生活的最小的生物—支原体(Mycoplasma)的C值不到106bp一些被子植物和两栖类动物的C值则可多达1011bp两者相差10万倍。C值同生物的进化有什么关系?生物的C值，即基因组的DNA总量是不是随着生物的进化而相应地增加?一方面：在一些低等生物中，随着生物进化，增加了生物体的结构和功能的复杂性，基因组也相应地增大即C值↑。如蠕虫的C值大于霉菌、酵母、细菌和支原体。矛盾之处1、同类生物C值差异很大2、有些进化程度低的生物C值大大超过进化程度高的生物的C值显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类骨鱼类软骨鱼类棘皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类霉菌藻类真菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌枝原体另一方面：随着进一步的进化，在其他生物中则看不到这种规律。从总体上说生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理。C-valueparadox:thelackofdirectrelationshipbetweentheCvalueandphylogeneticcomplex.人们对C值悖理已经提出许多解释：包括基因组的部分或完全加倍、转座、反转录已加工假基因、DNA复制滑动、不等交换和DNA扩增等，Petrov等又提出一个解释是：各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量的非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果，即DNA丢失的速率愈慢，那么基因组DNA含量愈高。C值悖理(Cvalueparadox)各种已测序生物的基因组，其注释的蛋白质编码基因数目:人——3300Mb，约25000个基因；线虫（C.elegans）——97Mb，19000个基因；果蝇（D.melanogaster）——120Mb，13600个基因；啤酒酵母(S.cerevisiae)——12Mb，约6000个基因；水稻（O.sativa）——389Mb，37544个基因6.1.2N值悖理(Nvalueparadox)果蝇基因组＞线虫基因组，进化地位比线虫高，而编码基因反而比线虫少；人的基因组应该是最复杂的，人的进化地位最高，但编码的基因还没有水稻基因组的多。显然，要理解每一个物种发育、代谢、生长、繁殖、行为等等的本质，仅用基因组的序列测定的结果是不能直接地回答这些问题的。在对基因组进行注释后，人们试图用基因组的结构和基因数目的多少来説明基因的功能以及各物种间的关系也不是一个简单的问题。生物的基因数目与生物进化树的位置不存在正相关的现象N值悖理。N值悖理真核生物基因组DNAC值和N值悖理现象都反映了DNA序列的复杂度问题，为此可通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。也就是通过DNA的变性（denaturation）和复性（renaturation）反应的动力学过程来分析DNA序列的性质。6.1.3真核生物基因组DNA序列的复杂性同一类生物中基因组大小相差悬殊，其主要差别在于“多余”(excess)DNA的量的差别。“多余”DNA量多，则基因组大；反之，则小。所谓“多余”DNA主要是重复序列，即这种DNA序列在基因组中可以有不止一个拷贝。不同序列的总长度称为序列复杂性或：DNA分子中不重复碱基的总量（用bp来表示）或：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值例如：（TATA）40其总长为160bp，但不重复的碱基只有2个：AT所以序列复杂性x=2(bp)而（TAGC）40其总长也为160bp，但序列复杂性x=4(bp)若一个DNA分子长度为106bp，完全不含重复顺序，则x=106(bp)序列复杂性(sequencecomplexity)基因组内单一序列和重复序列的组成情况，可通过DNA复性动力学研究来确定。DNA复性:当变性DNA的两条互补链在除去变性因素后，可以重新或部分恢复成双螺旋结构。复性的必要条件：足够的盐浓度;温度适中（低于Tm20-25℃）复性过程缓慢：成核作用→拉链作用当两条单链DNA接触时，如果某个区段可以互补配对，就先形成一个双链核心区，然后扩展其互补配对区段而复性形成双链。DNA复性动力学DNA复性是一个双分子二级反应，复性的速率取决于互补DNA序列间的随机碰撞。k1dsDNA2ssDNAk2单链消失速度的微分方程为：或C：单链DNA的浓度（核苷酸mol/L），t：时间（s），k：重组速率常数，即二级反应常数。当t＝0时，C＝C0，将上式积分：当t＝0时，C＝C0时，表明所有DNA都是单链，C0为DNA总浓度。单链DNA所占比例C/C0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数，该函数绘成图称为C0t曲线当50％的单链复性时，即t＝t½,C/C0＝1/2时,C0t½＝1/kC0t½横坐标C0t纵坐标1-C/C0当条件一定时：C0t½的大小与DNA的分子量及复杂性有关不同生物基因组的C0t½不同，C0t½的位置除了决定于基因组的大小外，还取决于每个基因的核苷酸序列的重复次数，重复次数越少，复性越慢，C0t½的位置越后。C0t½越大，表示复性速度越慢，DNA的分子量越大DNA总量一定时，基因组越复杂，任何特定顺序的拷贝数就越少。在没有重复序列时C0t½与基因组的大小成正比在有重复顺序的复性中,在同一个复性曲线上的各动力学组分的C0t1/2并不因基因组的大小而增减,而是与DNA序列的重复频率成反比：C0t½（1）：C0t½（2）＝f(2):f(1)式中（1）和（2）代表两个不同的动力学组分，f代表其重复频率（拷贝数）通常用大肠杆菌DNA作为标准测定未知DNA的复杂度：Ecoli的C0t1/2＝4.0，其基因组复杂度X=4.2×106真核生物基因组的复性曲线往往出现2个或3个明显不同的位置，说明这类基因组中包含着重复次数显然不同的几个组分高度重复序列占25%中度重复序列占30%非重复序列占45%基因组DNA分子可以根据其结构和功能从不同角度分成不同的类别。（1）基因序列和非基因序列基因序列指基因组里决定蛋白质(或RNA产物)的DNA序列，一端为ATG起始密码子，另一端则是终止密码子。在分析基因组序列时，当一个DNA序列以ATG起始密码子开始，随后是一个个密码子，但还未发现与这个序列对应的蛋白质产物，此时，这种DNA序列称为可读框(openreadingframe，ORF)。一般说，一个ORF相当于一个基因，只是其产物还有待发现和证实。非基因序列则是基因组中除基因以外的所有DNA序列，主要是两个基因之间的间插序列(interveningsequence)。(2)编码序列(Codingsequence)和非编码序列(Non-codingsequence)编码序列指编码RNA和蛋白质的DNA序列。由于基因是由内含子和外显子组成，内含子是基因内的非蛋白质编码序列。所以基因的内含子序列以及居间序列的总和统称为非蛋白质编码序列。(3)单一(unique)序列和重复(repetitive)序列单一序列是基因组里只出现一次的DNA序列。基因序列多半是单一序列，但也不全是单一序列，因为有些基因在基因组内的拷贝数不止一个。同时，非基因序列中也有单一序列。比如用作遗传标记或作图界标的短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)的侧翼序列和序列标定位点(sequencetaggedsite，STS)等。重复序列:是指在基因组中重复出现的DNA序列①轻度重复序列一般指一个基因组内有2—10份拷贝，但有时2—3份拷贝的DNA序列也被视作非重复序列。组蛋白基因和酵母tRNA基因属于轻度重复序列。②中度重复序列一般指10份到几百份拷贝的DNA序列，通常是非编码序列。这类重复单位平均长度约300bp，往往构成序列家族，同单一序列相隔排列，分散在基因组中。可能在基因活性的调控中起作用。③高度重复序列一个基因组中有几百份甚至几百万份拷贝的高度重复序列，重复单位平均长度约6－200bp。既有重复几百份拷贝的基因，如rRNA基因和某些tRNA基因，更多的则是很短的非编码序列的重复。这些序列往往是许多份拷贝呈头尾衔接的串联形式，也就是串联重复序列(tandemrepeat)。不同生物基因组中重复序列所占比例有很大差别：原核生物基因组中基本上不含有重复序列；低等真核生物，重复序列＜20％，且多半是中度重复序列；动物细胞，中度和高度重复序列约占50％；一些显花植物和两栖类，中度和高度重复序列几乎可以高达80％。高度重复序列：重复单位平均长度约6－200bp，重复次数106以上中度重复序列：重复单位平均长度约300bp，重复次数10－几百非重复序列，单拷贝序列：在基因组中1－3拷贝。6.2真菌类的四分子分析与作图6.2.1顺序四分子的遗传分析6.2.2非顺序四分子的遗传分析粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）低等真核生物，属于子囊菌可在一个共有的子囊（ascus）中产生子囊孢子(ascospore)同时具有无性生殖和有性生殖过程子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与处在减数分裂中期赤道板上的染色单体的排列顺序完全一致6.2.1顺序四分子的遗传分析粗糙脉孢菌的生活周期及子囊孢子子囊孢子粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）单倍体子囊孢子A交配型单倍体子囊孢子a交配型细胞融合顺序四分子(orderedtetrad)粗糙脉孢菌减数分裂的4个产物保留在一起，称为四分子(tetrad),子囊的外形是如此的狭窄，以致分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴之中，故所有分裂后的核——8个子囊孢子都从上到下顺序排列成行。可推知，第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对子囊孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体；第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体的同源染色体的姊妹染色单体。所以，脉孢菌减数分裂所产生的四分子属于顺序四分子A.着丝粒作图(centromeremapping)——单基因定位定义：利用四分子分析法，测定基因与着丝粒间的距离。原理：在一对非姊妹染色单体间，着丝粒和某杂合基因座间无交换：四分子等位基因排列为MI模式;若发生交换：其四分子的排列方式为MII模式。发生交换－MII模式减数分裂IIA和a才分开无交换－MI模式减数分裂IA和a就分开例如：赖氨酸合成基因lys的着丝粒定位lys＋×lys－杂交子代产生6种子囊类型，每种类型均统计其4个孢子对的基因型lys＋：野生型，成熟孢子呈黑色；lys－：缺陷型，子囊孢子呈灰色。赖氨酸合成基因lys的着丝粒定位所以，lys基因与着丝粒间的图距是7.3cM发生交换的子囊只有半数孢子是重组型B.两个连锁基因的作图利用四分子分析法也可对两个基因进行连锁分析和作图。例如：两个菌株杂交n＋×＋a烟酸依赖型nic（n）：培养基添加烟酸才能生长；腺嘌呤依赖型ade（a）：培养基添加腺嘌呤才能生长表6－4粗糙脉孢菌n＋×＋a杂交结果子囊型①②③④⑤⑥⑦＋a＋＋＋＋＋a＋a＋＋＋＋＋a＋＋＋anan＋nanan＋nan＋＋＋＋a＋＋＋a四分子基因次序n＋nanan＋n＋nan＋分离发生的时间MIMI