第六章食品中常检病原微生物的检验技术.

第六章食品中常检病原微生物的检验技术病原微生物是严重危害人体健康的一种指标菌。病原微生物检验它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过病原微生物的检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类，动物和食物中毒的防治措施，有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。食品中不允许有任何病原微生物，一旦检出，则该食品卫生质量不合格。目前食品中经常检验的致病菌有沙门氏菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及志贺氏菌等。通过本章学习要达到以下目的：1、了解食品的质量与常检病原微生物检验的意义。2、掌握常检病原微生物的生物学特性。3、掌握常检病原微生物的生化试验的操作方法和结果的判断。4、掌握食品中常检病原微生物检验的方法。第一节沙门菌检验学习目的与要求1.掌握志贺菌的生物学特性。2.掌握沙门菌的致病性。3.掌握沙门菌的检验程序。•一、沙门氏菌的生物学特性•（一）培养特性：需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上生长良好，菌落中等大小，无色半透明、圆形、光滑、湿润。3•（二）生化特性：•大部分发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨酸产气；•一般不发酵乳糖和蔗糖，不发酵侧金盏花醇；•一般不产吲哚，V-P反应阴性；•不分解尿素，苯丙氨酸不脱氨；•三糖铁琼脂斜面常产生H2S。45二、沙门菌检验（一）检验所需器材与培养基1、器材除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱（2℃~5℃），恒温培养箱(36±1℃、42±1℃)，均质器，振荡器，电子天平（感量0.1g），全自动微生物生化鉴定系统等。2、培养基缓冲蛋白胨水（BPW），四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，亚硫酸铋（BS）琼脂，HE琼脂，木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，沙门氏菌属显色培养基，三糖铁（TSI）琼脂等。（二）检验程序检样25g样品+225mLBPW1mL+SC10mL1mL+TTB10mLBSXLD(HE、显色培养基)挑取可疑菌落非沙门氏菌生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-反应结果与左侧描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙门氏菌，血清学试验报告TSI，赖氨酸，靛基质，尿素（pH7.2），KCN42℃±1℃,18h~24h36℃±1℃,40h~48h36℃±1℃,18h~24h36℃±1℃,18h~24h36℃±1℃,8h~18h•前增菌：食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。加工食品均应经过前增菌。•（选择性）增菌：此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。未经加工的食品不必经过前增菌而直接增菌。•选择性平板分离：采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。•生物化学筛选：排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。•血清学技术鉴定培养物菌种。二、沙门菌检验共分5个步骤：注意事项1、亚硫酸铋琼脂BS，使用注意事项：不可过度加热；使用前一天配制，且在48h内使用；倾注平板前需摇匀；不能反复溶解；平板需避光保存于室温环境。2、一株待检菌需同时接种氰化钾试验管和氰化钾对照管各一支。两管均需滴加无菌液体石蜡覆盖液面，因为氰化钾易分解，产生氢氰酸，易挥发，影响试剂浓度。思考题•1、进行沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？•2、沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？为什么？第二节金黄色葡萄球菌检测学习目的与要求1.掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。2.掌握金黄色葡萄球菌的致病性。3.掌握金黄色葡萄球菌的检验程序。一、生物学特性（一）培养特性金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4，干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径0.5~1.0μm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。•1、分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气；•2、甲基红反应阳性，V-P反应弱阳性；•3、许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。（二）生化特性（三）致病性•金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。•葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。•当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。14二、金黄色葡萄球菌检验（一）检验所需器材与培养基1、器材除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱(36℃±1℃)，冰箱(2℃~5℃)，恒温水浴箱(37℃~65℃)，天平(感量0.1g)，均质器，振荡器，无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、（10mL具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头，无菌锥形瓶(容量100mL、500mL)，无菌培养皿(直径90mm)，注射器(0.5mL)，pH计或pH比色管或精密pH试纸。2、培养基10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，7.5%氯化钠肉汤，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，脑心浸出液肉汤(BHI)，兔血浆，稀释液(磷酸盐缓冲液)，营养琼脂小斜面，革兰氏染色液，无菌生理盐水。血平板18h~24hBaird—parker平板18h~24h或者45h~48h25g（ml)样品+225mL75%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质Baird—parker平板，血平板涂片染色BHI肉汤和营养琼脂小斜面血浆凝固酶试验36℃±1℃18h~24h36℃±1℃观察溶血报告（二）检验程序注意事项1、平板分离：在Baird-Parker平板上，菌落为圆形，直径2~3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。2、革兰氏染色及镜检：金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5~1μm。思考题•1、金黄色葡萄球菌在血平板或B-P平板上的菌落特征如何？为什么？•2、食品中能否允许有个别金黄色葡萄球菌存在？为什么？•3、鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么？第三节志贺菌检验学习目的与要求1.掌握志贺菌的主要生物学特性、检验程序和检验方法。2.了解志贺菌的致病性。3.了解其他肠道杆菌。一、生物学特性（一）培养特性：需氧或兼性厌氧菌，最适温度37℃，pH6.4~7.8，在普通琼脂培养基和SS平板上，形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、中等大小的菌落，半透明的光滑型菌落。宋氏致贺菌菌落较大，较不透明，粗燥而扁平，在SS平板上可迟缓发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。•（二）生化特性•1、分解葡萄糖，产酸不产气。除宋氏致贺菌，均不发酵乳糖；•2、VP试验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用柠檬酸盐作为碳源；•3、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷；•4、甲基红阳性、靛基质不定；•5、痢疾致贺菌不分解甘露醇，其它（福氏、鲍氏、宋内氏）均可分解甘露醇。（三）、致病性致病物质：1.侵袭力：菌毛可粘附回肠和结肠粘膜上皮细胞，并侵入细胞内生长繁殖，在粘膜固有层形成感染灶引起炎症反应。2.内毒素：①作用于肠粘膜使其通透性增高，促进内毒素吸收，形成内毒素血症（高热、意识障碍、中毒性休克）；②直接破坏肠粘膜。形成炎症溃疡、出血，呈典型的脓血粘液便；③还可以作用于肠壁植物神经，使其肠蠕动失调和痉挛（直肠括约肌最明显）出现腹痛、里急后重的症状。3.外毒素：此与霍乱弧菌、ETEC产生的毒素相同。其作用有三：①肠毒素性：引起早期的水样腹泻；②细胞毒性，对Vero细胞、Hela细胞、血管内皮细胞、肾小管内皮细胞、人肝细胞均有毒性；③神经毒性或致死毒性：注入家兔可使其麻痹、死亡。二、检验程序检样25g+GN225mLHE琼脂或SS麦康凯或EMB挑取可疑菌落TSI，葡萄糖半固体TSI底层产酸，斜面产碱，H2S-，不产气，无动力血清学分型生化分群试验志贺氏菌属分群及分型结果进一步的生化试验葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸、尿素、氰化钾（KCN）、水杨苷和七叶苷葡萄糖铵+或任何其他阳性结果非志贺菌非如左述的各种结果非志贺菌报告36℃±1℃,6h~8h36℃±1℃,18h~24h1、志贺菌属分几个群，各群有多少个血清型？2、志贺菌属在三糖铁尿素半固体琼脂斜面上的生化反应是什么？3、志贺菌四种多价血清指哪几种？思考题注意事项1、三糖铁尿素半固体为三糖铁琼脂与尿素半固体两者合并的复合培养物，可以同时测定葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵、产酸、产气情况，并观察H2S的生成，尿素分解和动力；斜面上的菌苔可做玻片凝集试验。2、由于分解葡萄糖后产酸使PH降低，中层及斜面变黄。同时又因为细菌利用蛋白胨后产生的代谢物，在斜面微氧环境下产碱使斜面变红，而中层保持厌氧状态，不易氧化及挥发。仍为黄色。3、尿素加热过高，过久可使尿素酶分解变红；如加热不足又可造成灭菌不彻底。因此关键问题是准确控制灭菌温度及其加热时间。第四节致泻大肠埃希氏菌检验学习目的与要求1.掌握致泻大肠埃希氏菌的主要生物学特性。2.掌握致泻大肠埃希氏菌的致病性。3.掌握致泻大肠埃希氏菌的检验程序。•（一）培养特性1)需氧及兼性厌氧菌2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2-7.4。3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。4)在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。•一、埃希氏菌属生物学特性5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见β溶血环。6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌落9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色•埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落•在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌大肠埃希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）•（二）生化特性1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致;3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希