藏药翁布中黄酮类的生物活性研究

生命与地理科学学院学士毕业论文藏药翁布中黄酮类的生物活性研究论文作者：杨玉发系别：生物技术（制药）专业、年级：生物制药专业2007级学号:20071911221指导教师:曾阳（教授）论文起止时间：2010年5月～2010年5月论文提交时间：2010年5月11日论文答辩时间：2010年5月13日青海师范大学生命与地理科学学院制青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第1页（共7页）目录摘要......................................................错误!未定义书签。Abstract...................................................错误!未定义书签。引言......................................................错误!未定义书签。1.实验材料.................................................错误!未定义书签。1.1实验材料............................................错误!未定义书签。1.2实验试剂、仪器......................................错误!未定义书签。2.实验方法.................................................错误!未定义书签。2.1DPPH自由基清除活性的测试...........................错误!未定义书签。3.实验结果................................................错误!未定义书签。3.1DPPH自由基清除活性测试结果.........................错误!未定义书签。4.实验讨论...............................................................85.实验结论.........................................................................................................................................参考文献.................................................................10致谢.....................................................................11青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第2页（共7页）摘要目的:本文主要研究藏药翁布(MyricaricapaniculataP．Y．ZhangetY．J．Zhang)中黄酮类化合物对DPPH自由基的影响。方法:DPPH自由基清除活性测试按照YoshidaT等方法进行。Ascorbicacid(维生素C)作为阳性对照。将100ul系列浓度的供试品溶液和100ul的DPPH溶液共置于96孔板中，室温下放置30min后测定517nm波长下的吸光值A。DPPH自由基清除能力按照公式：抑制率%=100×(Ablank-Asample)/Ablank进行计算，并以SC50值(清除半数DPPH自由基所需的样品浓度)反映供试品抗氧化能力的强弱情况。结果：显示藏药翁布中的黄酮类化合物可显著降低DPPH的活性。结论：藏药翁布中黄酮类化合物具有DPPH自由基清除活性。关键词：藏药翁布；黄酮类；DPPH自由基；清除活性青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第3页（共7页）AbstractObjective:ThispaperstudiesTibetanombu(MyricaricapaniculataP.Y.ZhangetY.J.Zhang)offlavonoidsonDPPHfreeradical.Methods:DPPHradicalscavengingactivitytestinaccordancewiththeYoshidaTandothermethods.Ascorbicacid(vitaminC)asapositivecontrol.Seriesofconcentrationofthe100ulsamplesolutionand100ulofDPPHsolutionwereplacedin96-wellplatesatroomtemperaturefor30min,517nmwavelengthmeasuredabsorbanceA.DPPHradicalscavengingcapacityinaccordancewiththeformula:inhibitionrate%=100×(Ablank-Asample)/Ablankcalculated,andSC50values(neededtoremovehalfoftheDPPHfreeradicalsampleconcentration)reflectstheabilityofthetestthestrengthofantioxidantsituation.Result:intheTibetanfabricWengflavonoidscansignificantlyreducetheactivityofDPPH.Conclusion:TheTibetanombuofflavonoidswithDPPHradicalscavengingactivity.Keywords:Tibetanombu;flavonoids;DPPHradical;scavengingactivity青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第4页（共7页）引言黄酮类化合物概况：黄酮类化合物(flavonoids)是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，在植物体内大部分与糖结合成苷类，还有部分是以游离态苷元的形式存在。绝大多数植物中都含有黄酮类化合物，对植物的生长、发育、开花、结果以及防菌防病等方面有着重要的作用[1]。黄酮类化合物种类繁多，分子结构差异显著，但是其基本母核为2-苯基色原酮，是均含有C6-C3-C6的基本框架，即泛指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列有机化合物，其基本结构为：目前，已发现的水柏枝属植物中黄酮类成分主要有黄酮和黄酮醇两类，周嵘等[2]从宽苞水柏枝（M.bracteata）中分离到7个黄酮类成分，分别为3,5,3',4'-四羟基-7-甲氧基黄酮，3,5,4'-三羟基-7,3’-二甲氧基黄酮，3,5,4'-三羟基-7-甲氧基黄酮，槲皮苷，山奈酚，槲皮素和柯伊利素；李帅等[3，4]从三春水柏枝(M.paniculata)中分离到1个双黄酮鼠李秦素，7-甲氧基山奈酚，鼠李素，槲皮素；赵东宝等[5]从宽苞水柏枝(M.bracteata)和小花水柏枝(M.wardii)中分离到3个黄酮类成分，分别为3,5,3',4'-四羟基-7-甲氧基黄酮，kaempferol-3-O-rhamnoside,3-dehydroxy-7-acetyl-quercetin。自由基与人体一些重大疾病有一定的相关性,Harman提出的自由基学说[3]认为:自由基攻击生命大分子造成的损伤是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等疾病的重大原因,这一学说已被越来越多的人所接受。近年来,对自由基及其清除剂的研究成为热点,寻找、筛选具有阻断自由基形成或抑制细胞膜过氧化活性的药物研究越来越受到人们的关注,其中对翁布的研究是自由基清除剂研究中的热门领域之一[6]。DPPH:1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)。暗紫色大棱柱形晶体，mp127～129度（分解）。一般试剂含量不小于98％，该品具有刺激性。吸入、口服或皮肤接触有害。大量使用应穿适当的防护服和戴手套。主要用途是阻聚剂。也常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价。DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。DPPH法:DPPH法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质好和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收.利用DPPH溶液的紫红色吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定[7]本文翁布为实验材料,采用DPPH自由基法对翁布清除自由基活性进行了研究,以期为翁布的合理开发利用提供参考依据,为从天然植物材料中寻求生物活性成分提供一条新的途径。青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第5页（共7页）1.实验材料、试剂与仪器1.1实验材料藏药翁布枝叶的60%丙酮提取物中分离得到11个黄酮类化合物，分别鉴定为3,5,4'-三羟基-7,3'-二甲氧基黄酮(1),3,5,4'-三羟基-7-甲氧基黄酮(2),3,5,3',4'-四羟基-7-甲氧基黄酮(3),3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮(4),柽柳素(5),山柰酚(6),槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(7),5,7,4'-三羟基-3-O-β-D-葡萄糖醛酸(8),5,7,3',4'-四羟基-3-O-β-D-葡萄糖醛酸(9),槲皮苷(10),阿福豆苷(11)1.2试剂与仪器DPPH自由基Sigma-Aldrich公司维生素C上海新兴化工试剂研究所EmaxE11498酶标仪美国MolecularDevices公司AE240Mettler电子天平瑞士梅特勒公司乙醇为分析纯2.实验方法2.1DPPH自由基清除活性测试DPPH自由基清除活性测试按照YoshidaT等方法[8]进行。Ascorbicacid(维生素C)作为阳性对照。精密称取DPPH4mg加乙醇配制成浓度为200umol/l的溶液，精密称取各供试品和阳性对照约1mg，溶于100ulDMSO中,再加900ul乙醇的供试品溶液。然后2倍逐步稀释，配制成10个系列浓度。将100ul系列浓度的供试品溶液和100ul的DPPH溶液共置于96孔板中，室温下放置30min后测定517nm波长下的吸光值A。每个供试品重复试验3次，空白对照组为100ul乙醇和100ul的DPPH溶液。DPPH自由基清除能力按照公式：抑制率%=100×(Ablank-Asample)/Ablank进行计算，并以SC50值(清除半数DPPH自由基所需的样品浓度)反映供试品抗氧化能力的强弱情况。3.实验结果3.1DPPH自由基清除活性测试结果本文对化合物1-24的DPPH自由基清除活性进行了测试，结果见表12。由表12可知，阳性对照Vc的DPPH自由基清除SC50为50.3μM，化合物2、4、5、6和10的SC50均小于阳性对照，表明化合物具有DPPH自由基清除活性(强于维生素C)。表12.抗氧化活性实验结果Table13.Theresultofantioxidant化合物DPPHSC50(μM)166.4±0.4227.9±1.2371.5±0.5青海师范大学生命与地理科学学院本科毕业论文第6页（共7页）444.5±0.2550.1±0.5642.5±0.87232.5±0.48332.1±219274.6±141046.5±1.211853.1±32SC50：清除半数DPPH自由基所需的样品浓度。相对标准偏差(n=3)4.实验讨论酚类化合物是植物中最重要且分布最广泛的物质之一，在植物界已知有8000种以上，主要由黄酮、酚酸和单宁等三类物质构成，由于酚类物质结构中含有较多的羟基，因此它们具有天然的抗氧化活性。黄酮类化合物的抗氧化性与其化合物结构有关。黄酮类化合物B环上的3,4-邻二羟基是具有清