蛋白质-配基相互作用的鉴定

10.蛋白质－配基相互作用的鉴定1TimothyPalzkill2张晓君、毛跃建、李旻、张晶、赵琴丽、徐灵筠译；申剑初校；张晓君修校3410.1前言5基因组测序计划已鉴定了大量的以前未知的基因。然而，甚至对于已被深入研究6的模式生物，如大肠杆菌和酿酒酵母，大约三分之一的基因的功能仍未知。了解7基因组中所有基因的功能的挑战促进了高通量实验技术的发展，并因此推动了大8规模描绘蛋白质－蛋白质以及蛋白质－配基的相互作用。9蛋白质－蛋白质相互作用在功能性细胞内扮演着重要的角色。在基因组规模上确10定蛋白质的相互作用可建立蛋白质相互作用网络，这种网络可为基因产物的功能11提供重要的线索。例如，如果一个未知功能的蛋白可与已知功能的一族蛋白相互12作用，说明这个蛋白与它们具有相同的功能（Schwikowski等，2000）。蛋白质13－蛋白质相互作用的鉴定可以通过提供它们与复合体的结合模式为生物学过程14的机制的了解提供新观点。例如，即使知道一类蛋白参与某个生物学过程，我们15也不知道这些蛋白是否或怎样与复合体相互作用以实现它们的功能。蛋白质－蛋16白质作用谱图提供了蛋白质相互作用的详细信息因此提供复合体组织的精确信17息。18本章综述了在基因组规模上蛋白质相互作用的研究方法。包括如酵母双杂交系统19的在体方法和一些体外方法，如质谱、噬菌体展示和蛋白芯片等。2010.2开放阅读框的高通量克隆21测定基因组规模的蛋白功能的功能基因组研究依赖于开放阅读框的高效克隆。开22放阅读框必须被克隆到可以大规模表达或便利地对编码蛋白进行功能性分析的23质粒载体。由于所有蛋白不可能在一个系统中得到一样好的表达，对所感兴趣的24基因应构建到多个蛋白表达系统。例如，用各种细菌的启动子测定可以确定哪个25系统最适合表达。此外，对于功能分析，将感兴趣的基因插入载体用于噬菌体展26示、双杂交分析或谷胱苷肽S转移酶（GST）融合。如果我们使用传统的采用限27制性内切酶和DNA连接酶的克隆技术，构建这样一套载体所用的时间和费用将28是不可想象的。但是，替代的新方法已可以便利地快速克隆PCR产物。2910.2.1λ噬菌体att重组克隆30λ噬菌体位点专一重组系统已被用于创建有效的克隆系统。λ噬菌体具有裂解31和溶源循环。在溶源循环，噬菌体不复制而将DNA整合到宿主的染色体上32（Ptashne，1992）。一旦λ噬菌体感染后，溶源过程马上开始，λDNA环化、33Int蛋白启动环状DNA整合入染色体。Int蛋白催化λ噬菌体结合位点（aatP）34和E.coli结合位点(aatB)的位点专一的重组。一个称为整合宿主因子（IHF）的35E.coli宿主蛋白对λDNA的整合也是必需的（Landy,1989）。整合反应具有高度的36序列专一性，没有任何核苷酸的冗余与缺少。这个位点专一的重组并非同源重组，37因为attB和attP有很大差异。这个位点有15个碱基对的核心序列5＇-38GCTTTTTTATACTAA。由于同源的区域很小，在没有Int蛋白时重组无法进行。attB39和attP重组后的位点称为attL和attR（图10.1）(Landy,1989).40λ噬菌体DNA保持为前噬菌体状态直到宿主细胞被损坏（Ptashne，1992）。DNA41损伤引发λint和xis基因的表达。Int和Xis表达产物催化细菌染色体上λDNA42的剪切。在aatL和aatR位点的剪切产生aatB和aatP位点。剪切反应并非整合43反应的简单的逆向反应，除了Int和IHF蛋白还需要Xis蛋白（Landy，1989）。44所以，利用适当的重组蛋白可以控制重组反应的方向。45λ重组克隆系统方法就是将两端带有att重组位点的DNA和载体与整合蛋白一46起保温使DNA片段插入载体（Hartley等，2000）。这个系统被称为重组克隆(RC)47（Hartley等，2000）。此系统可被用于直接将PCR片段克隆到载体而无需DNA48连接酶。插入PCR片段的反应是attB＋attPattL＋attR，与λ噬菌体插入相似49也是被另加的Int和IHF蛋白催化。反应底物是带有attB位点的PCR片段和两50端带有attP的选择性标记的质粒（图10.1）。与λ噬菌体插入不同的是，此反应51用了两个attB和两个attP，此外，att位点被突变使attB1只能与attP1而非attP252重组。att位点的改造使得PCR片段可以直接克隆到载体（图10.1）(Hartley等，532000)。54以RC法克隆PCR片段的最后结果是载体带有两端含attL位点的标记基因。55此质粒被称为起始克隆(Entryclone)，因为它可以通过重组反应来产生各种功能56载体（Hartley等，2000）。用于载体转换的反应是attL+attRattB+attP,类似于57λ噬菌体被Int、Xis和IHF蛋白剪切（Landy，1989）。通过对两种载体和Int、58Xis及IHF蛋白的共同温育，起始克隆的基因被转到带转录启动子和蛋白标签的59目的载体。该反应不同于λDNA从染色体的切除，因为起始克隆带两个attL位60点且目的载体带两个attR位点（Hartley等，2000）。att位点被突变以保证只在61attL1和attR1及attL2与attR2之间发生重组。重组反应通过形成一个复合体来62进行，而且最终将形成一个带有感兴趣的基因及启动子和标签序列的目的载体图6310.1)。64RC系统最近被用于几个大规模克隆工程。例如，从Caenorhabditiselegans中克65隆基因以酵母双杂交系统构建用于蛋白质表达和分析蛋白质相互作用的载体66（walhout等，2000）。到最近为止已用此系统克隆了超过12000个C.elegans的67基因（Reboul等，2003）。此外，大于100个人cDNA已用此法克隆创建了一套68起始克隆。这些克隆以适合的载体转为GFP融合载体，测定了这些cDNA表达69的蛋白的细胞定位（Simpson等，2000）。7010.2.2拓扑异构酶法克隆71痘病毒拓扑异构酶I载体另一条避免DNA连接酶的克隆途径是拓扑异构酶介72导的克隆。此法利用痘病毒DNA拓扑异构酶I以很高的序列专一性切断和连接73DNA链（Shuman，1992a,b）。反应时，酶识别5’-CCCTT序列并在末尾的T切74开，在断开链的3’磷酸基团与酶分子的酪氨酸残基之间形成共价键（图10.2）。75共价复合物可以与带5’羧基并与复合物的尾部互补的异源受体DNA形成重组分76子（Shuman，1994）。77拓扑异构酶I克隆利用上述的反应将DNA片段连接到带5’羧基并可与拓扑异构78酶共价结合的受体质粒。反应只在有自由的5’羧基的DNA存在时才会发生，这79很有利于克隆PCR产物，因为当用不带5’磷酸的引物扩增的产物都不带5’磷酸80基团（Shuman，1994）。最近这个方法被用于从酿酒酵母克隆了6035个开放读81码框到一个酵母蛋白表达质粒和一个哺乳动物表达载体（Heyman等，1999）。82原始的拓扑异构酶克隆方法的缺点是PCR产物可以任意方向插入。克隆系统最83近被改进可以对PCR产物进行定向克隆（图10.2）。该系统仅需要在设计引物时84在引物的5’末端加入5’CACC。5’CACC序列与质粒－拓扑异构酶复合体的5’端85互补，由此控制PCR产物的插入方向（图10.2）。此系统被用于从梅毒病源86Treponemapallidum的基因组克隆了99％的开放读码框（McKevitt等，2003）。87拓扑异构酶I克隆方法提高了克隆的效率，可以将大量的开放读码框插入到质粒88载体。8910.2.3酵母的在体重组克隆90通过转化克隆上述的λ重组克隆系统利用体外重组然后转化到E.coli细胞。91替代的体内方法利用酵母高效的同源重组机制克隆了大于99％的酿酒酵母基因92（～6000）（Uetz等，2000）。这用两步PCR完成，首先，一套大约6000个引物93对从酿酒酵母中扩增它的开放读码框,每个正向引物有特定开放读码框的序列和945’端22碱基的所有引物相同的序列，反向引物有特定开放读码框序列和20碱基95的共有序列（图10.3）。6000个开放读码框随后被分别扩增得到一套PCR产物。96第二套PCR反应引物以第一套PCR所用引物中的共有序列为基础。正向引物取9722碱基共有序列，反向引物取20碱基共有序列，另外还带有50碱基与作为受98体质粒的酵母载体克隆位点两侧的序列同源的序列（Hudson等，1997；Uetz等，992000）。PCR产物将在两端各带有70碱基的序列，它们与受体载体的克隆位点100两侧的70碱基同源。101每个PCR产物与被限制性内切酶在克隆位点切开而线性化的受体载体一起转化102到酵母（图10.3）。在PCR产物的两端70碱基的同源序列足以使酵母的同源重103组系统将PCR插入到载体中（Hudson等，1997；Ma等1987）。10410.2.4重组克隆系统的优缺点105每个重组克隆方法都是将PCR产物克隆入期望的载体序列的有效手段。拓扑异106构酶克隆的主要优点是对扩增每个ORF所用的引物的5’端所需要的额外序列最107小。只需要在正向引物5’端加四个碱基即可有效地进行定向克隆，而不需在反向108引物添加额外核苷酸。但以λ重组克隆系统克隆PCR产物却需要在正向和反向109引物都加25个额外的核苷酸（Hartley等，2000）。110以酵母重组克隆PCR产物的主要优点是简单易行。但是由于需要在PCR产物的111两端带有至少50bp的与载体的序列同源的序列，因此需要进行两轮的PCR反应。112多轮PCR反应会增加PCR产物的序列发生突变的可能性。此外，第一轮PCR113反应的引物在每个ORF之外又额外增加了20到22个碱基序列，这将会增加引114物合成的成本。115总之，重组的克隆方法极大地便利了大量的开放读码框的高通量克隆。而这又使116下面讨论的功能基因组实验变得可行。11710.3酵母双杂交选择系统118酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的有力工具。它是基于位点专一的转录激119活子的模块特性（Fields和Song，1989）。杂交蛋白由蛋白X与DNA结合域的120融合及蛋白Y与转录激活域的融合组成。如果蛋白X和蛋白Y发生相互作用，121将会重建转录因子并导致报告基因的表达（图10.4）。DNA结合域常被称为“诱122饵”，而激活域被称为“陷阱”。123数个不同版本的双杂交系统被广泛地使用。大多使用DNA结合域与Gal4转录因124子的融合。另一个版本利用将E.coliLexA的DNA结合域融合到感兴趣的蛋白的125氨基端来创建‘陷阱’。这个系统需要在报告基因的上游设置一个LexA结合位点。126陷阱由Gal4激活域或另外的酸性激活域组成，如E.coli序列的B42。这个陷阱127可以与Gal4或LexA的DNA结合域“诱饵”搭配（Brent和Finley，1997）。各128种诱饵的常用的报告基因是E.coli的lacZ基因，它编码半乳糖苷酶。Gal4或LexA129的结合位点设置于lacZ基因的上游。蛋白的相互作用以激活域与DNA结合域共130同激活lacZ基因的转录进行检测（Fields和Song，1989）。基因激活可通过β131半乳糖苷酶的产物使克隆在X－Gal平板上显蓝色来检测。132使用双杂交系统的难点在于消除假阳性。假阳性克隆来自于诱饵和陷阱蛋白的非133专一的结合所导致的报告基因的转录的激活。例如，任何诱饵蛋白的自我激活转134录就会导致假阳性。但自我激活转录可以通过用构建的诱饵克隆筛选报告基因的135激活而消除。某些报告系统具有很高的假阳性背景（James等，1996）。为克服136这些问题，新版的双杂交系统使用多个表型的报告基因检测基因的激活。在一个137新的版本中，使用了HIS3、ADE2和lacZ为报告基因（James等，1996）。此外，13