第十一章固相膜免疫分析技术

检验学院何涛【目的要求】1、掌握：免疫金标记技术、胶体金、免疫金的概念，金免疫测定技术的类型、原理和临床应用；2、了解：斑点酶免疫吸附试验、免疫印迹试验。概述•固相膜免疫分析技术以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细血管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或各种有色微粒子标记抗体或抗原作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。固相膜免疫分析技术其他膜载体免疫分析技术胶体金免疫技术斑点酶免疫吸附试验免疫印迹试验斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫层析试验第一节胶体金免疫技术•胶体金免疫技术：是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术。一、胶体金与免疫金的制备（一）、胶体金的特性1、胶体特征•胶体金也称金溶胶，是由•金盐被还原成原子金(Au)•后形成的金颗粒悬液。•胶体金颗粒大小多在1~100nm，微小金颗粒稳定、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。•2、呈色性和光吸收性•3、稳定性对电解质较敏感，电解质可破坏胶体金外周水化层，而使其聚体沉淀下来。（二）胶体金的制备向一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子还原成为金原子，形成金颗粒悬液。常用的还原剂有：枸橼酸钠、白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、鞣酸等。以枸橼酸钠为例说明制备方法：1、制备一定浓度的HAuCl4水溶液，加热至沸。2、搅动下准确加入一定量的枸橼酸三钠水溶液。3、继续加热煮沸一定时间。观察溶液变化：淡黄色灰色黑色红色。4、冷却至室温后加蒸馏水恢复至原体积。胶体金的鉴定主要鉴定指标有：颗粒大小、粒径的均一呈度、有无凝集颗粒。良好的胶体金应该是清亮透明的，如混浊或液体表面有漂浮物，提示制备的胶体金有较多的凝集颗粒。胶体金的保存：胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存。制备胶体金的注意事项：(1)氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。(2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此，在配制及保存时不能用金属器皿。(3)制备胶体金的水应是双蒸馏水或三双蒸馏水。(4)用于制备胶体金的玻璃容器必须是约对清洁的。（三）免疫金的制备胶体金与抗原(抗体)的结合物称为免疫金或胶体金标记物。免疫金的制备方法：1、胶体金溶液的PH调整：PH值的确定原则上是选择标记蛋白质的等电点。2、蛋白质最适标记量的确定：用稀释法确定。蛋白质不足的管颜色由红变蓝；蛋白质足的管保持红色来变。3、标记过程：在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓度的蛋白溶液加入胶体金溶液中，反应一定时间后加入BSA并调整至PH8.5，放置室温数分钟。4、离心去除未结合的蛋白质。（一）斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)原理：是以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜帖置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的。阳性反应在膜上呈现红色斑点。二、胶体金免疫技术的方法种类和原理（二）斑点金免疫层析试验(DIGA)原理：是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的固相膜免疫技术，与斑点金免疫渗滤试验的过滤性能不同，DIGA中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判断实验结果。A.B都为吸水材料，R为金标抗体干片，T区包被特异性抗体，C区包被羊抗兔免疫球蛋白抗体（1）双抗体夹心法•A（2）间接法（3）结果判断（三）临床应用及评价优点：本法操作简单、快捷以及操作人员不需技术培训，无需仪器设备试剂稳定，便于保存，已成为“床旁检验”的主要方法之一。缺点：只能定性不能定量，且灵敏度不如酶标法和酶发光免疫测定。因此金免疫技术在临床上常用于快速筛查试验。第二节其他膜载体免疫分析技术一、斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）二、免疫印迹试验