蛋白质浓度的测定方法总结

一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】1.学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。2.掌握紫外分光光度计的操作方法。【实验原理】大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】1.实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。2.实验试剂(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。【实验操作】1.绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂：管号0123456试剂标准蛋白质溶液(ml)0.00.51.01.52.02.53.0蒸馏水(ml)8.07.57.06.56.05.55.0蛋白质浓度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.6250.750试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。2.测定未知样品取样品溶液4毫升,加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。【实验结果】根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。三．双缩脲法（Biuret法）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9L'BPn!试剂与器材试剂：'T!`$d3V,J%A（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05NNaOH配制。1^)^+}:~1L2~N?6C（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。器材：)m,W4G%C9~,w)O1.可见光分光光度计)qA4S8X9t,n2.比色杯3.大试管15支4.旋涡混合器等。操作方法2G0?3_+^-h)FV1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2.样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。四．BCA方法测定蛋白质含量【实验目的】掌握用BCA方法测定蛋白质含量的原理和操作方法【实验原理】BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。【实验材料】1.实验器材721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。2.实验试剂(1)BCA试剂的配制①试剂A，1L：分别称取10gBCA(1%)，20gNa2CO3H2O(2%)，1.6gNa2C4H4O62H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。②试剂B，50ml：取2gCuSO45H2O(4%)，加蒸馏水至50ml。③BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。【实验操作】1.绘制标准曲线取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。管号123456标准蛋白溶液（μl）蒸馏水（μl）BCA试剂（ml）蛋白质含量（μg）025050502005201001505401501005602005058025005100上述试剂加完后，混匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以第1管为对照，在562nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品测定准确吸取250μl样品溶液于一干燥洁净的试管中，加入BCA试剂5ml，摇匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。【实验结果】根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。五．Lowry法[目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。[原理]蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。[操作]取试管7支、编号、按下表操作：立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。操作注意事项：1．按顺序添加试剂2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。[计算](一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。[器材](一)721型分光光度计(--)恒温水浴箱(三)中试管7支(四)刻度吸管：1.0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。[试剂](一)试剂甲(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液(2)0.2N氢氧化钠溶液(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。(一)试剂乙：(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。(2)或取Na2WoO42H2Ol00g和Na2MOO325g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO450ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。(三)标准蛋白质溶液用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。六．考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度目的要求学习考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(