蛋白质纯化试题整理

名词解释1.截留分子量(molecularweightcut-off,MWCO)：不能通过膜的最小分子量2.超滤：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法3、陶南效应：离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面的微环境中，H＋被吸引而OH－被排斥，交换剂表面pH比周围低1个pH单位；而阴IE表面的微环境中，H＋被排斥，交换剂表面pH比周围高1个pH单位4、离子交换剂的有效（实际）交换容量：指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量5.聚沉（coagulation）是指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物（＞1mm）的过程•常见的聚沉剂：无机盐类（如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝），聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）•聚沉条件：-20℃以下，pH3~6，较高离子强度，高多价金属离子（Fe3+、Al3+）6.絮凝（flocculation）是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程•常见的絮凝剂：淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物•絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑；应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件7、盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升8、盐析：但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出9、透析：利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法。对于蛋白质样品，透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐（如硫酸铵）10、排阻极限：指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量11、凝胶颗粒的分级范围：指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围12、过滤：利用多孔介质（滤纸、滤膜等）阻截大的颗粒物质，而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。主要用于悬浮液的分离，最简单、最常用13、离子交换剂的电荷密度：指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量，它决定着离子交换剂的总交换容量14、离子交换剂膨胀度（吸水值）：指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示（ml/g）15、梯度洗脱：进行梯度洗脱时，洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的，洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的16、阶段洗脱：指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱，而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱17、亲和层析：利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用，对蛋白质进行分离纯化的层析技术。18、等电聚焦电泳：利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带。19、双向电泳（2-dimensionElectrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS-PAGE20、蛋白质印迹（WesternBlotting）是指把从电泳或层析分离得到的蛋白质转移到固定介质上后，再利用特异性“探针”（抗体）检测固定介质上的特定蛋白质的方法。它能更有效地分析电泳结果21、免疫电泳（immuneelectrophoresis）是基于以及抗原与抗体的特异性免疫沉淀反应而应用的一项电泳技术22、毛细管电泳（CE）：是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的一类新型液相分离技术简答1.超滤法浓缩蛋白样品的基本原理？优点？局限性？基本原理：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法优点：超滤浓缩技术的优点是操作简便，不需添加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。在蛋白质分子的制备技术中，超滤除用于浓缩外，还可用于蛋白样品的脱盐和脱水局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度2.判断已知等电点的蛋白质，在不同PH值溶液中的带电性3.手动加样法的具体操作填装好的凝胶柱经平衡后，用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液，待洗脱液下降至近床表面2-3mm时，关闭柱出口（注意不能使洗脱液全部流干）；用胶头滴管吸取一定体积的样品液后，贴柱内壁旋转缓缓加入，以防加样过快导致凝胶床面表面受损；加样完毕后，打开柱出口，让样品液缓慢渗入凝胶床内；当样品液面恰与凝胶床表面持平时，贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内部，并使洗脱液高出凝胶床表面2-3cm，即可进行恒流洗脱。4.手动装柱，如何检测装柱质量a、对光检查。对光肉眼观察装填平衡好的凝胶柱，柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱（如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等），来观察洗脱过程中中色带下降均匀与否，判断装柱质量。如果色带歪曲弥散，则需重新装柱。5、离子交换剂按功能基团类型不同可分为？强阳离子交换剂（强酸型）弱阳离子交换剂（弱酸型）强阴离子交换剂（强碱型）弱阴离子交换剂（弱碱型）6、疏水作用层析分离蛋白质混合物的基本原理？疏水作用层析（HIC）是利用不同蛋白质分子表面疏水性的差别，来分离蛋白质混合物的一种层析技术蛋白质分子表面常常暴露着一些疏水性基团，这些疏水性基团可以与疏水层析的固定相发生疏水性相互作用（疏水作用力）而结合7、共价层析分离含半胱氨酸的蛋白或多态混合物的基本原理？共价层析是利用固定相与目标蛋白分子之间共价键的先形成、后断裂过程来实现目标蛋白从混合样品中分离的层析方法。要求在温和的条件下，既能与固定相形成稳定的共价键，又能在释放蛋白时不破坏蛋白的活性，蛋白质分子中通常只有巯基基团能满足这一要求因此，共价层析主要用于分离和纯化含巯基（即含半胱氨酸）的蛋白质或多肽8、离子交换层析分离效果用分辨率（RS）来描述，分辨率的定义？决定因素？RS定义为两个洗脱峰峰顶对应的洗脱体积（VR或Ve）之差比上两峰在基线上峰宽之和的平均值。一个IEC系统能够达到的RS取决于该系统的三个层析参数：容量因子、柱效率和选择性。k′——容量因子（保留因子）N——柱效率（即理论塔板数）——选择性9、凝胶过滤层析特点？用途？特点：（1）介质不带电荷，不溶于水，亲水性好，具化学惰性，不与被分离蛋白发生化学反应，分离条件温和，不会使蛋白变性失活（2）分离效率高，回收率较高（3）广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化，脱盐等（4）一般采用细长柱（5）经过凝胶过滤层析分离后样品将被稀释，因此上样前需对样品进行浓缩用途：（1）蛋白质样品的脱盐及缓冲液更换蛋白质与盐的分子量差异较大，选用交联度高的介质（如SephadexG-25），使蛋白质不能进入凝胶颗粒内部网孔，先流出层析柱，而盐分子能进入，后流出层析柱层析过程的洗脱中可使用需更换的缓冲液，从而在脱盐的同时达到将样品的缓冲液也进行更换的目的（2）蛋白质的分级分离应用不同蛋白分子量的差异进行分离，凝胶介质和蛋白质之间不发生任何作用，所以层析过程能不改变蛋白的生物学活性。凝胶过滤层析通常用在离子交换层析或亲和层析之后，用以进一步分离纯化目的蛋白（3）蛋白质分子量的测定10、描述聚丙烯酰胺的电泳（PAGE）中考马斯亮蓝染色法以及银染法原理？考马斯亮蓝染色法原理：在酸性条件下，蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物（595nm处最大吸收峰），蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比关系银染法原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色显色方法分为化学显色和光显色11、常规PAGE和SDS-PAGE使用试剂最主要的差别是？后者加入去垢剂SDS烷基硫酸钠和强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）12、SDS-PAGE分离蛋白质混合物的原理？去垢剂SDS十二烷基硫酸钠，CH3(CH2)11OSO3Na，破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，并与之结合形成SDS-蛋白质复合物；强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），破坏蛋白分子二硫键结果导致：SDS-蛋白复合物带上大量负电荷，且不同蛋白质有着相同的荷质比（SDS与多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质）蛋白分子变成椭圆棒状，不同的蛋白分子无形状差别，棒的长度与其分子量成正比因此，对于SDS-PAGE，蛋白质的迁移率仅与分子量有关。电泳过程中蛋白质天然构象被破坏，生物学活性丧失问答题1、蛋白质的沉淀法：优点？局限性？常用的沉淀法有哪几种？优点：所需设备简单，操作方便，在蛋白质纯化的初期，可以加速减少样品体积，起到浓缩的作用，便于后续的纯化降低纯化成本；还可以尽快将目的蛋白与杂质分开提高目的蛋白的稳定性；通过该方法，目的蛋白的回收率提高局限性：由于沉淀法对提高蛋白质纯度的幅度比较有限，该法常只用于蛋白质的初步纯化常用方法：有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、结晶等电点聚乙二醇沉淀法选择沉淀方法时，需要考虑沉淀剂对目的蛋白质的蛋白质稳定性的影响，沉淀剂的成本及操作的难易程度、沉淀剂的去除及残留、目的蛋白的纯度要求及收率。2、蛋白质样品的浓缩方法？基本原理分别是？•沉淀：蛋白质在水中的溶解度受蛋白质分子表面疏水性和亲水性带电基团分布的影响，这些基团与水溶液的离子相互作用，通过改变pH和离子强度，加入有机溶剂或多聚物，可以促进蛋白质分子聚集，形成蛋白质沉淀，通过离心或过滤可以获得沉淀物，然后利用合适的缓冲液清洗，溶解沉淀物，在经过透析或凝胶过滤，除去残留溶剂成分•吸附：吸收水和小分子，当凝胶完全膨胀后，用过滤或离心方法除去凝胶，分离出蛋白质样品，适用于稳定性较差的蛋白质。•超过滤：在离心力和较高压力下，选择适应孔径的半透膜，从而使水和其他小分子透过半透膜，而所需的蛋白质不能透过膜。•双水相分离法：利用两种多聚物或多聚物与盐在水中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离纯化蛋白质，同时起到浓缩作用。•透析：把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，袋内的水分等小分子物质可透过半透膜逐渐移至袋外，有效成分则留在袋内。•冷冻干燥：在真空状态下，置于冻干机的冰冻抽提液可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不被破坏。3、良好的凝胶过滤介质应满足？要求；常用介质？（英文名）良好的凝胶过滤层析介质应满足以下要求：凝胶颗粒内部具有三维网孔结构：能使不同分子量的蛋白质得以分离亲水性高，具有表面惰性：即介质与蛋白质之间不发生化学或物理相互作用稳定性强：在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长机械强度较高：允许较高的操作压力（流速）（1）葡聚糖凝胶SephadexG-数字（数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小）（2）琼脂糖凝胶①Sepharose（2B,4B,6B）②SepharoseCL（2B,4B,6B）③Superose（6,12）（数字表示琼脂糖含量，数字越大，琼脂糖含量越大，分级范围越小）（3）复合结构凝胶①SephacrylHR（S-数字HR）②Superdex（peptide,30,75,200）（数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小）4、影响蛋白质电泳速度的内在因素、外在因素有？常用的电泳技术？常规PAGE有哪三大分离效应？内在因素：蛋白质分子所带电荷的电性和电量：电性决定电泳方向；电量越大，迁移速度越快。蛋白质分子的大小和形状：分子质量