第十四章-高效液相色谱法.

第十四章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC概述概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段。特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。高效液相色谱与经典液相色谱比较经典液相色谱高效液相色谱常压或减压高压，40～50MPa填料颗粒大填料颗粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000块/m分析速度慢分析速度快色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物几乎可以分析各种物质不能分析热不稳定物质可以分析热不稳定物质用毛细管色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长，柱效不会很高有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器(FID和TCD)没有较高灵敏的通用检测器流动相为气体，无毒，易于处理流动相有毒，费用较高运行和操作容易运行和操作比GC难一些仪器制造难度较小仪器制造难度大高效液相色谱与气相色谱比较5高效液相色谱法的分类根据分离机理•液-液分配色谱•化学键合相色谱•液-固吸附色谱•离子交换色谱•离子色谱•离子对色谱•尺寸排阻色谱•亲和色谱需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。根据固定相分类•液-液色谱•液-固色谱6根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系或方法。反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性，（反相：流动相的极性大于固定相；正相：流动相的极性小于固定相）。最初形成于液液分配色谱，现已广泛应用于其他各种色谱方法。正相色谱和反相色谱7高效液相色谱仪1.储液瓶（输液管入口端安装有过滤器）；2.高压输液泵；3.混合器和阻尼器；4.进样器（阀）；5.色谱柱；6.检测器；7.废液瓶；8.数据处理和控制系统8现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。流动相贮器和溶剂处理系统9高压输液系统•储液罐•高压输液泵要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调流量范围宽，耐腐蚀分类：恒流泵（机械泵）恒压泵•过滤器•压力脉动阻力器机械注射泵机械往复泵多用于流量要求在1-50L/min范围的微型HPLC或毛细管柱HPLC中活塞泵隔膜泵10高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样阀进样系统1112高压进样阀（六通阀）进样装置隔膜注射进样器色谱柱顶端装入耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。分离系统色谱柱131.色谱柱类型按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。高效液相色谱柱2.保护柱一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。3.柱恒温器对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。14在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。•一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。•另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。检测系统15l.光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极管阵列检测器，红外吸收检测器2.荧光检测器3.示差折光率检测器4.电化学检测器5.蒸发光散射检测器6.质谱检测器液相色谱检测器161.紫外吸收(UV)检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。光吸收检测器172.紫外光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。1820.2.5.1.光吸收检测器2.紫外光电二极管阵列检测器1920.2.5.1.光吸收检测器2.紫外光电二极管阵列检测器20紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极管阵列检测器213.红外吸收检测器与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。光吸收检测器22高灵敏度、高选择性对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。荧光检测器(FluorescenceDetector，FD)23除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。示差折光检测器（DifferentialRefrativeIndexDetector,RI）24电化学检测器基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等。1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱。25蒸发光散射检测器(EvaporationLightScatteringDetector,ELSD)1.色谱柱出口;2.液压释放口;3.氮气入口;4.雾化器;5.加热漂移管;6.样品液滴;7.激光光源;8.排气口;9.光电检测器;10.放大器;11.连接记录系统。A.色谱柱洗出液雾化区；B.溶剂蒸发区;C.样品粒子光散射。26质谱检测器（Massspectrometrydetector,MSD)27是一种灵敏度高，专属性强，能提供分子结构信息，是非常理想的检测器。它作为一种质量型检测器在近年有较大的发展，其中以分析生物大分子的生物制品发展尤为迅速。①分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；③定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；④检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。附属系统•脱气•梯度淋洗•预饱和柱和预柱•恒温•自动进样•馏分收集•数据处理2829梯度淋洗(gradientelution)梯度淋洗是指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。梯度淋洗对于一些组分复杂及容量因子值范围很宽的样品分离尤为必要。HPLC中的梯度淋洗的作用十分类似于气相色谱中的程序升温，两者的目的都是为了使样品的组分在最佳容量因子值范围流出柱子，使保留时间过短而拥挤不堪、峰形重叠的组分或保留时间过长、峰形扁平、宽大的组分，都能获得良好的分离。梯度淋洗的优点：可以改进复杂样品的分离，改善峰形，减少拖尾并缩短分离时间。另外，由于滞留组分全部流出柱子，可保持柱性能长期良好。固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。高效液相色谱固定相和流动相30由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当溶解能力等。3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。流动相311.溶剂强度参数ε0定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积上的吸附自由能，表征溶剂分子对吸附剂的亲和力大小。2.溶解度参数δ它是溶剂与溶质分子间各种作用力的总和，包括色散力、偶极作用力、接受质子能力、给于质子能力等。3.极性参数P’表示每种溶剂与乙醇、二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用力的度量，类似于气相色谱固定液的Rohrschneider常数，反映溶剂接受质子、给出质子和偶极相互作用能力及选择性差异，亦作为表征溶剂洗脱强度的指标。流动相溶剂的特性参数3233优化保留值k和分离选择性α的重要方法是改变流动相溶剂类型和组成。溶剂组成优化用差试法比较麻烦、费时，成功率不一定很高。采用溶剂组成与溶剂强度参数关系的估算,可减少优化实验操作。二元混合溶剂极性参数P’与其体积组成呈线性关系，可按算数平均值求出。例如溶剂A和B混合物的极性参数PAB’可按下式求出:'''ABAABBPPP34混合溶剂ФA与ФB分别表示溶剂A和溶剂B在混合溶剂中的体积分数。高效液相色谱法的主要类型根据分离机制不同，可分为以下几种类型：•分配色谱法，包括液-液分配色谱法和化学键合相色谱法；•液-固吸附色谱法；•离子交换色谱法；•尺寸排阻色谱法；•亲和色谱法。35研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，即化学键合固定相至载体或基质表面。化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱类型。分配色谱(PartitionChromatography)36液-液分配色谱(LLP