第十章免疫分析技术

医学检验教研室宜春职业技术学院第十章免疫分析技术和相关仪器学习要求掌握临床免疫检验常用仪器的特点;熟悉临床免疫检验常用仪器的分析原理;了解临床免疫检验常用仪器的使用与维护。主要内容酶免疫分析仪发光免疫分析仪放射免疫分仪析仪免疫浊度分析仪时间分辨荧光免疫分析仪第一节酶免疫分析仪第一节一、酶免疫技术的分类二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及结构三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养四、酶免疫分析仪的临床应用•根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:酶扩大免疫测定非均相酶免疫测定克隆酶供体免疫测定液相酶免疫法均相酶免疫测定固相酶免疫法(ELISA）一、酶免疫技术的分类基本概念二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构酶标仪一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐。全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育、震荡、洗板和酶标仪功能于一体。（一）酶免疫分析仪的类型-1微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪)半自动微孔板ELISA分析仪全自动微孔板ELISA分析仪管式固相酶免疫测定仪器小珠固相酶免疫测定仪器磁微粒固相酶免疫测定仪器等（一）酶免疫分析仪的类型-21.微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪)有单通道和多通道两种类型工作原理与主要结构和光电比色计相同和不同之处在于：比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通过待测液酶标仪的工作原理图2.自动化酶免疫分析系统在酶标仪的基础上再加上配置:加样系统温育系统洗板系统判读系统机械臂系统液路动力系统软件控制系统系统优势-1•自动化程度高：前后处理一体化设计，减少人与样品的接触机会，降低污染。能进行各种自动安全检测。•稳定：只要避免人为操作错误，可连续数年良好工作。•准确：不存在交叉污染，确保结果准确。系统优势-2•高速：加注、读板速度快•扩展性：软件可升级，样本量增加，可联机使用•用户做主更多：开放式试剂；WINDOW操作系统；中/英/日自选操作界面；自定义编程；自动/自定义时间表；无限存档。三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养（一）性能评价1．滤光片波长精度检查及其峰值测定；2．灵敏度和准确度；3．通道差与孔间差检测；4．零点漂移；5．精密度评价；6．线性测定；7．双波长评价；三、酶免疫分析仪的性能评价及维护保养（二）维护保养重点：光学部分1．滤光片波长精度检查2．通道差与孔间差检测四、酶免疫分析仪的临床应用１.病原体及其抗体的检测2.各种免疫球蛋白和细胞因子、补体3.肿瘤标志物4.多种激素5.药物和毒品等。第二节发光免疫分析仪将发光反应与免疫反应相结合的免疫分析方法•采用微量倍增技术，敏感性度，特异性好，所用试剂安全、稳定；•检测范围广泛，从传统的蛋白、激素、酶乃至药物均可检测•发展迅速，各种仪器不断出现，自动化程度越来越高。一、发光免疫的分类-1酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统闪光（Flash）发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(InSituInjector)和时间积分法测量辉光（Glow）发光时间在数十分钟以上，如：-HRP-Luminol系统-AP-AMPPD系统-黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。按发光持续时间一.发光免疫的分类-2时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰闪光-辉光测量方式差别消除放射性危害无半衰期限制，试剂稳定性、有效期延长实现连续、动态、重复测定优越性-1闪光-辉光测量方式差别•适合于复合标记系统多指标测定•操作简单，反应快，易实现自动化•灵敏度和线性范围超过以往技术优越性-2闪光-辉光测量方式差别三.发光免疫技术分类根据示踪物检测的不同而分为：荧光免疫测定电化学发光免疫测定化学发光免疫---再根据标记物的不同又分：-化学发光免疫分析-微粒子化学发光免疫分析-电化学发光免疫分析-化学发光酶免疫分析-生物发光免疫分析临床以前三者较为常用。三.发光免疫分析的基本测定方法根据发光反应检测方式的不同可分为1．液相法反应在液相中进行，经离心或分离措施后，再进行测定发光强度2．固相法将抗原抗体复合物结合在固相载体(如聚苯乙烯管)或分离介质上(如磁性微粒球等)，再进行测定发光强度3．均相法同均相酶免疫法，不需要经过离心或分离步骤，即可直接进行发光强度检测夹心法特点分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。功能灵敏度：测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。线性范围：功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度。相关系数：≥0.99的曲线范围。四、发光免疫分析仪的种类、工作原理和基本结构(一)全自动化学发光免疫分析系统采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的免疫分析系统(一)全自动化学发光免疫分析系统1．仪器测定原理该类分析技术有两种方法：-竞争法测定小分子抗原物质-夹心法测定大分子抗原物质竞争法特点分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值。功能灵敏度：（变异）≤20%的最低可检测浓度。线性范围：功能灵敏度-变异≤20%的最高检测浓度。相关系数：≥0.99的曲线范围。(一)全自动化学发光免疫分析系统•一般由主机和微机两部分组成：•（1）主机部分：包括原材料配备部分：反应杯、样品盘、试剂盘、纯净水、清洗液、废水在机器上的贮存和处理装置。液路部分：过滤器、密封圈、真空泵、管道、样品及试剂探针。机械传动部分：传感器、运输轨道。光路检测部分：光电倍增管和线路控制板。2．仪器组成全自动化学发光免疫分析系统66IMMUNOLOGY(一)全自动化学发光免疫分析系统2．仪器组成（2）微机系统程控操作指示判定数据处理故障诊断自动监视（二)全自动微粒子化学发光免疫分析系统采用微粒子化学发光技术对人体内的微量物质以及药物浓度进行定量测定具有高度的特异性、高度的敏感性和高度的稳定性等特点全自动微粒子化学发光免疫分析系统1.分析方法采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为发光剂，扩大测定的范围。以免疫测定方法为基础：-竞争法-夹心法-抗体检测等2.分析过程抗原抗体结合；加入碱性磷酸酶标记的抗体；形成固相包被复合物；在电磁场中进行2~3次洗涤分离；加入底物；通过光量子阅读系统记录发光强度；在标准曲线上计算出待测抗原的浓度。3.仪器组成微电脑控制样品处理系统实验运行系统中心供给和控制系统•电化学发光免疫分析技术在新一代实验室免疫检测技术中很有特点，它在20世纪如年代一问世就引起广泛的关注•德国公司在链酶亲和素—生物素包被技术基础上，引用电化学发光免疫分析技术并开发出相应的全自动电化学发光免疫检测系统1.测定原理及过程•待测标本与包被了抗体的顺磁性微粒和发光剂标记的抗体共同温育（形成磁性微珠包被抗体—抗原—发光剂标记抗体复合物）•吸人流动室，缓冲液冲洗•磁性微粒流经电极表面时，被电极下的磁铁吸引，而游离的发光剂标记抗体被冲洗走同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钉[Ru(bpy)3]2+TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光光的强度与待测抗原的浓度成正比2.仪器组成及特点•由样品盘、试剂盒、温育反应盘、电化学检测系统及计算机控制系统组成•应用三种抗原抗体反应方法：-抑制免疫法检测小分子量蛋白抗原-夹心免疫法检测大分子量物质-桥联免疫法检测抗体如IgG、IgM另：钉标记用于DNA／RNA探针分析主要应用于以下几方面检测：•1．甲状腺系统•2．性腺系统•3．血液系统•4．肿瘤标记物•5．心血管系统•6．血药浓度•7．感染性疾病•8．其他检测（Ig、血清皮质醇、尿皮质醇、尿游离脱氧吡啶等）第三节放射免疫分析仪放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性结合•放射免疫技术主要包括：-放射免疫分析(,RIA)-免疫放射分析或免疫放射度量分析(IRMA)一、放射性核素的种类特点和检测仪的基本结构（一）放射性核素的种类和特点放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、57Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用一、放射性核素的种类特点和检测仪的基本结构（二）检测的基本结构及其探测原理将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能）。电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记录的cmp值）反映了发出射线的频率电脉冲的电压幅度则反映了射线能量的高低。二、晶体闪烁计数器组成和工作原理（一）仪器组成及工作原理1．闪烁体2．光电倍增管（1）光阴极（2）打拿极（3）阳极3．多道脉冲分析器多道分析器（MCA）是进行能谱分析的重要仪器。现代的MCA与通用微型计算机有许多共同特性，是现代核探测分析及放射影像装置的重要组成部分。（二）γ-辐射计数器整机可分为：采样部分---探头、换样装置、高低压电源、放大器及单道组成数据处理部分---接口、计算机、输入输出装置三.放射免疫分析仪的应用常用于测定：激素微量蛋白质肿瘤标志物药物第四节免疫比浊分析仪现在临床上测定微量蛋白(如Ig等)已发展到现代自动免疫分析技术，其灵敏度逐步提高，检测水平由微克到纳克，甚至皮克水平。微量蛋白免疫分析随着自动化程度不断提高，在临床上得到广泛应用，其自动化检测方法主要为免疫比浊法免疫比浊法免疫透射浊度测定法免疫透射比浊法免疫胶乳浊度测定法终点散射比浊法免疫散射比浊法速率散射比浊法光路示意图如下：免疫分析比浊技术的主要优势(1)稳定性好，敏感性高(2)分析简便、快速(3)避免标本之间及标本对人的污染(4)标本用量少（一）免疫透射比浊测定免疫透射比浊度测定(turbidimetry)免疫透射比浊测定免疫胶乳浊度测定光路示意见下图：1.免疫透射比浊测定原理抗原抗体在缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过剩时，形成的复合物随抗原增加而增加，反应液的浊度亦随之增加。2.免疫胶乳浊度测定法原理选择均匀一致的胶乳颗粒吸附抗体，当遇到相应抗原时，发生凝集；单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝集时，则使透过光减少，减少的程度与胶乳凝聚成正比。（二）激光散射浊度测定激光散射浊度测定(nephelometry)分为：-终点散射比浊法(endnephelometry)-速率散射比浊法(ratenephelometry)基本原理：激光散射光系沿水平轴照射，碰到抗原—抗体复合物时，导致光线被折射，发生偏转0o～90o，其偏转角度因光线波长、离子大小不同而有所区别。散射光的强度与抗原-抗体复合物的含量成正比，和散射夹角成正比，和波长成反比。1.终点散射比浊法抗原—抗体反应达到平衡时（通常为30～60分钟），复合物浊度不再受时间的影响，在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。散射比浊法是测定抗原与抗体结合完成后测定其复合物的量。2.速率散射比浊法速率是指抗原—抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率散射比浊法是在抗原与抗体反应的最高峰(约在1分钟内)测定其复合物形成的量，该法具有快速、准确的特点。3.激光散射浊度测定仪(1)ARRAY特种蛋白分析测定系统由微电脑控制，可以定量检测体液中微量蛋白的全自动组合仪器。仪器主要部件（1）散射测浊仪光源采用双光源碘化硅晶灯泡(400-620nm)；（2）加液系统具有液体感知装置，控制加液体积的准确性；（3）试剂和样品盘（4）阅读器读取卡片内贮存的参数。仪器主要特点：IC悬浮颗粒所产生的散射光速率变化强弱与抗原浓度成正比；速率峰值经微电脑处理转换成抗原浓度；测到所需的速率峰值后，仪器通过峰值鉴定程序再对此峰值进行确证；抗原过剩的监测在抗原过剩的情况下，仪器重新对标本进行稀释，然后再次测定；使用抗体、标准血清、抗体卡片和校正卡片。•DB100特种蛋白分析测定系统，由分析仪、计算机打印机、条码读取器四部分组成。分析仪是该系统的主要部分，