第四章基因工程汉译英原文

原文逆转录病毒介导的表达筛选，基本原理和应用逆转录病毒介导的表达克隆在20世纪90年代中期发展起来。借助逆转录病毒载体的cDNA基因库建设和用质粒载体没有区别。根据这个方法可以生成单向或双向的cDNA文库。互补的DNA用oligo-dT或随机六聚体核苷酸作引物来生产。文库以DNA溶液的形式保存，并且使用包装细胞系转换成逆转录病毒。要生成代表并包含cDNA文库的高复杂性的逆转录病毒，建议使用293包装细胞系，瞬时包装效率会更高。病毒的遗传特性包括高效价的逆转录病毒用来感染靶细胞，被感染的细胞可具有特定的性状而被选择出来。然后完整的cDNA可以用聚合酶链式反应（PCR）或逆转录PCR来恢复，来确定哪些cDNA与表现型有关哪些与基因序列有关。逆转录病毒介导的表达克隆的方法是有效的，因为在每个细胞的前病毒整合的数量是有限的。因此，它没有必要像在COS7细胞的常规方法一样恢复和重新引入质粒。逆转录病毒介导的表达克隆，感染效率应控制在10％和30％之间，以尽可能避免多个整合到一个细胞内。另外，我们可以通过转染一个辅助子构建包含gag-pol和env基因到一个独立的克隆来回收整合的逆转录病毒，在cDNA文库转导后已经获得了特定表型。在这种情况下，回收的逆转录病毒感染靶细胞从而确定其中哪个整合是与表现型有关的。相对于传统方法最重要的优点是可应用于任何功能性的鉴定即通过功能识别DNAs，因为一旦整合，逆转录病毒转移的cDNA表达一般是稳定的。逆转录病毒介导的表达克隆：一些实例各种功能检测都可以利用逆转录病毒介导的表达克隆。例如，许多病毒的细胞受体被确定是基于病毒感染。转染了从被感染细胞产生的文库的抗感染细胞用包含识别基因如GFP基因的感染病毒来筛选。从识别基因阳性细胞（即，被感染的细胞）恢复的cDNA编码一种他定的病毒的受体。人类免疫缺陷病毒（HIV）的联合受体和猿免疫缺陷病毒（SIV）通过这种方法从人类T细胞的cDNA文库识别。一个多变的和亲异的逆转录病毒的受体，它已被查出被认定使用同样的方法。肿瘤坏死因子（TNF）和Fas通过激活下游信号通路诱导凋亡。在细胞内引入cDNA文库方法后，一些细胞有可能通过表达逆转录引入的基因对肿瘤坏死因子和Fas的刺激有抗性。通过这种方法，一种新的转录因子BSAC和粘附分子ICAM-2已被分别确认为TNF诱导的及TNF和Fas一起诱导的细胞凋亡抑制剂。有趣的是，ICAM-2被发现激活的PDK-1，PI3K和Akt，从而抑制细胞凋亡。然而，根据功能对蛋白质的鉴定，有时会导致意想不到的重要发现。在另一个例子我们的研究中遇到了意想不到的结果。小鼠白血病M1细胞分化成巨噬细胞，并在白细胞介素-6的刺激下经历了细胞凋亡。Starr等人在通过逆转录病毒感染转导M1细胞cDNA文库后通过隔离IL-6抗性的M1克隆发现了一种细胞因子信号抑制剂，SOCS-1。同样的策略，我们确定了A1，一种bcl-2家族的抗凋亡蛋白，保护M1细胞免受IL-6诱导的细胞凋亡。我们还从IL-6抗性克隆发现了一种新型反义方向的GAPMgcRacGAP;反义MgcRac-GAPM1的表达保护细胞免受IL-6诱导分化和凋亡。另一方面，在HL60细胞过度的MGC-RacGAP诱导其分化为巨噬细胞。后续研究带来的一个意外的发现是，MgcRac-GAP对细胞分裂是必需的，尤其是胞质。调查细胞分裂和细胞分化之间的联系将会很有前景。因此，鉴定蛋白质的功能是细胞生物学的有力工具。