第四章基因工程载体.

第四章基因工程载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。一、载体（Vectors）广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。（3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害2.基因工程对载体的要求3.载体的种类基因工程中常用的载体有5类：质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）来源功能克隆载体:克隆一个基因或DNA片段表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中第一节质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒（1）分子小：1.质粒的一般生物学特性1—500kb（2）编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA,编码毒性糖蛋白）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。（4）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA③线形DNA（linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。②开环DNA（opencircular，ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒超螺旋质粒开环和线性质粒染色体DNA加入EB加入EB结合EB少结合EB多紧密密度高松散密度低密度梯度离心分离原理氯化铯密度梯度离心法步骤：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下注射器吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs过DowexAG50W-X8柱子，用数倍体积的TE/0.2mol/LNaCL清洗去除EB二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:非接合型质粒能自我转移不能自我转移1、依据质粒自身传递的性质分类除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫自我转移型质粒。1.接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（conjunction）2.非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。磺胺氨苄青霉素卡那霉素四环素链环素汞盐抗性带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类显性质粒:宿主细胞由于含有质粒而获得新性状隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状A.严紧型质粒（stringentplasmid）拷贝数少，只有1—3份拷贝。B.松弛型质粒（relaxedplasmid）拷贝数多，有10—60份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。3、依据质粒的复制特性分类三、质粒的不亲和性亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒。（攘外必先安内）不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。（1）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建1.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。（2）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（ORI）2.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片段。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。3.构建质粒克隆载体的基本原则A、选用合适的出发质粒。出发质粒（也称为亲本质粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、用于选择标记的基因、克隆位点B、获得构建质粒克隆载体的元件。C、组装合适的选择标记基因。D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量。E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）4.质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记①抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。a）抑菌原理b）细菌抗性原理Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b）细菌抗性原理Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理a）杀菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。b）细菌抗性原理Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。iv）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v）四环素（Tetracycline，Tet）b）细菌抗性原理a）抑菌原理通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。②遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。营养标记其他标记：如蓝白斑筛选当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素5.人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用。（3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。温度低（低于35oC），拷贝数很少；温度增加（35oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等构建。（4）插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性外源DNA无抗菌素抗性（5）正选择的质粒载体如pUR2、pTR262等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。DirectselectionvectorsSmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindⅢKil基因Pkn80（17kb）PKN80质粒带有来自Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，它编码一种kil基因，使Mu噬菌体非溶源菌株致死。HindIII位点上插入外源DNAHindIII位点无插入外源DNAKil基因无活性Kil基因有活性Mu噬菌体非溶源菌株致死Mu噬菌体非溶源菌株存活（6）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件?1）普通载体元件复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。五、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点2.ColE1（1）类型天然质粒，属高拷贝型。（2）长度6.3kb。（3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！①colicinE1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea+kil基因产物③不被其他细菌的colicinE1所杀死的原因imm基因EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位点ColicinE1外源DNA无Colicin用对外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作选择，操作非常繁杂。对colicinE1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicinE1的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷ColE1抗colicinE1杀ColE1-仍抗colicinE1不杀ColE1-插入片段ColE1pSP2124质粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件来源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9