类胡萝卜素形成酶基因及其生物代谢工程

1类胡萝卜素形成酶基因及其生物代谢工程类胡萝卜素通常是指C40的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物(叶黄素)两大类色素的总称。它们在结构上由8个类异戊二烯单位浓缩形成，典型的C40类胡萝卜素携带紫罗酮环（ionone），在环的不同位置可被氧基、羟基、环氧基代替[1]；类胡萝卜素分子中最重要的部分是决定颜色和生物功能的共轭双鍵系统，能使单态氧失活，猝灭羧基自由基。由于类胡萝卜素本身的化学特性，它们是所有光合生物的基本成分,贮存在生物体的脂相中。在植物中，类胡萝卜素对叶绿体的光合作用起着至关重要的作用，一方面，它们是叶绿体光合天线的辅助色素，帮助叶绿素接收光能；另一方面，它们在高温、强光下能通过叶黄素循环，以非辐射的方式耗散光系统Ⅱ（PSⅡ）的过剩能量保护叶绿素免受破坏[2,3]。除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝卜素无色外，绝大多数类胡萝卜素呈黄色、橙色或红色[4]，是许多植物花和果实呈现鲜艳色彩的原因[2]。类胡萝卜素也是合成植物激素ABA的前体[5]。约有10%的类胡萝卜素是维生素A（VA）的前体[6,7]，人体VA不足易得夜盲症。近年来，越来越多的医学研究表明，类胡萝卜素在猝灭自由基[8]、增强人体免疫力[9]、预防心血管疾病和防癌抗癌[2,10]等保护人类健康方面起着更为重要的作用。人体血液中主要含有番茄红素、β－胡萝卜素、叶黄质、β－隐黄质、α－胡萝卜素等类胡萝卜素[11]，但人体不能合成类胡萝卜素，主要依赖饮食中类胡萝卜素的供应。一些重要的类胡萝卜素如玉米黄素，和叶黄质一起，是眼睛斑点色素（macularpigment）中不可缺少的成分,但在食品中含量并不丰富，也不能通过外界药物供给，玉米黄素如长期摄入不足对眼睛健康极为不利[12]。随着类胡萝卜素药用价值的不断发现，人类对类胡萝卜素的种类和产量需求将越来越大。然而，类胡萝卜素很难通过化学合成，迄今为止，已鉴定的天然类胡萝卜素有600余种，但只有于少数几种类胡萝卜素如β－胡萝卜素、虾青素、角黄素等能通过化学合成进入商业化生产，它们主要用于营养补充、食品着色和动物饲料的添加；通过天然微生物发酵途径也能生产β－胡萝卜素、虾青素，但所占的市场份额微不足道[13]。显然，类胡萝卜素目前这种生产状况已不能满足市场的需求。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程生产类胡萝卜素开辟了道路，近年来，有关这方面的研究在微生物和高等植物上取得重大突破。1.类胡萝卜素的生物合成途径及其相关酶的基因克隆1.1类胡萝卜素的生物合成途径通过类胡萝卜素生物合成的生化分析、经典遗传学和近年来分子遗传学的研究，已经基本清楚类胡萝卜素的主要生物合成途径。然而对于复杂类胡萝卜素的末端基团、甲基基团及多烯烃链的额外修饰过程仍不太清楚[14]。所有的类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。IPP（异戊烯焦磷酸）是该途径的前体物质，IPP在IPP异构酶作用下生成DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸），然后再与3个IPP缩合依次生成GPP（牻牛儿焦磷酸）、FPP（法尼基二磷酸）、GGPP（牻牛儿2牻牛儿焦磷酸）。2个GGPP在Psy（八氢番茄红素合成酶）作用下形成第一个无色的类胡萝卜素――八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成α－胡萝卜素、β－胡萝卜素，在α、β－胡萝卜素的C4（C4，）引入酮基和（或）C3（C3，）引入羟基以及在β－环上引入C（5,6）－环氧基后,则形成更为复杂的叶黄素（图1）。1.2类胡萝卜素形成酶基因目前，已从细菌、真菌、藻类和植物等生物中分离出150多个类胡萝卜素形成酶基因，它们分别编码20多种类胡萝卜素形成酶[17]。这些基因的克隆成功为利用DNA重组技术通过微生物生产有经济价值的类胡萝卜素，以及改变植物类胡萝卜素的生物合成途径提高类胡萝卜素的产量提供了便利。编码早期类胡萝卜素生物合成的酶，如GGPP合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶的基因等占总体的一半以上，其中，八氢番茄红素脱氢酶基因包含两步、三步、四步和五步脱氢反应的不同基因。β－番茄红素环化酶基因从细菌和植物中克隆到，它能促进双环类胡萝卜素形成；ε－番茄红素环化酶基因仅从植物中克隆到，除莴苣ε－番茄红素环化酶基因外，一般只形成单环。迄今为止，仅有修饰类胡萝卜素β－环的酶基因得到克隆，包括β－胡萝卜素羟化酶、β－胡萝卜素加氧酶（或酮化酶）。在过去几年，已先后从植物上克隆到玉米黄素环氧酶、紫黄质脱环氧酶、辣椒红素/辣椒玉红素合成酶、新黄质合成酶。表1列出了调控类胡萝卜素生物合成的关键酶及其基因。2.微生物类胡萝卜素基因工程应用DNA重组技术将外源基因导入微生物，利用微生物繁殖快、产量高的特点生产人们需要的、有商业价值的化学物质，是现代生物技术制药工业的主要发展方向[20]。这一技术的关键是，作为外源基因宿主的微生物首先必须具备大量生产所需要化学物质的前体的能力[21]。有关类胡萝卜素的基因工程近年来在大肠杆菌和酵母上取得成功。2.1.大肠杆菌大肠杆菌不能形成类胡萝卜素，但它含有的成分如多萜醇、.苯醌和甲基萘醌类维生素与类胡萝卜素一样，都是由共同前体FPP转化而来[22]。因此，在理论上讲，向大肠杆菌中转入GGPP合成酶基因crtE后，可诱导体内部分C源转向类胡萝卜素的生物合成。图1　类胡萝卜素生物合成途径简图[2,14-16]异戊烯焦磷酸（IPP）牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）　八氢番茄红素六氢番茄红素-胡萝卜素链孢红素番茄红素-胡萝卜素-胡萝卜素-胡萝卜素叶黄质-隐黄质　玉米黄素环氧玉米黄素辣椒红素紫黄素辣椒玉红素　新黄质-胡萝卜素海胆酮角黄素虾青素3表1编码类胡萝卜素生物合成的酶基因[2,17-19]酶基因生物登录号类胡萝卜素骨架的构建GGPP合成酶crtE欧文氏菌ErwiniauredevoraD90087crtE集胞藻SynechocystisPCC6803D90899al-3粗糙脉孢霉NeurosporacrassaX53979Ggps拟南芥ArabidopsisthalianaL25813Ggps辣椒CapsicumannuumP80042八氢番茄红素合成酶crtB农杆菌AgrobacteriumaurantiacumD58420crtB集胞藻SynechocystisPCC6803X69172al-2粗糙脉孢霉NeurosporacrassaL27652Psy拟南芥ArabidopsisthalianaL25812Psy黄水仙LpseaspeciosaX78814Psy1番茄LycopersiconesculentumA21360Psy2番茄LycopersiconesculentumL23424无环类胡萝卜素的生物合成八氢番茄红素脱氢酶Pds拟南芥ArabidopsisthalianaL16237Pds玉米ZeamaysL39266Pds黄水仙LpseaspeciosaX78815Pds番茄LycopersiconesculentumM88683crtP集胞藻SynechocystisPCC6803X62574crtI荚膜红细菌RhodobactercapsulatusZ11165crtI欧文氏菌ErwiniauredevoraD90087al-1粗糙脉孢霉NeurosporacrassaM57465ζ-胡萝卜素脱氢酶crtQ集胞藻SynechocystisPCC6803X62574Zds拟南芥ArabidopsisthalianaU38550Zds辣椒CapsicumannuumX68058链孢红素羟化酶crtC球形红杆菌RhodobactersphaeroidesX82458链孢红素甲氧化脱氢酶crtD荚膜红细菌RhodobactercapsulatusZ11165链孢红素羟基-氧-转甲基酶crtF球形红杆菌RhodobactersphaeroidesX82458球形烯(加)氧酶crtA荚膜红细菌RhodobactercapsulatusZ11165环化类胡萝卜素生物合成番茄红素β环化酶crtY欧文氏菌ErwiniauredevoraD90087crtY集胞藻SynechocystisPCC6803X74599β-Lyc拟南芥ArabidopsisthalianaZ29211番茄红素ε环化酶ε-Lyc拟南芥ArabidopsisthalianaU50738β-胡萝卜素羟化酶crtZ农杆菌AgrobacteriumaurantiacumD58420Bch拟南芥ArabidopsisthalianaU58919Bch辣椒CapsicumannuumY09225玉米黄素转葡糖基酶crtX欧文氏菌ErwiniaherbicolaM87280β-胡萝卜素C(4)加氧酶crtW农杆菌AgrobacteriumaurantiacumD58420crtW产碱杆菌AlcaligenesPC1D58422crtO集胞藻SynechocystisPCC6803D64004CrtO/Bkt雨生红球藻HaematococcuspluvialisX86782/D45881玉米黄素环氧酶Zep1拟南芥ArabidopsisthalianaT45502Zep1辣椒CapsicumannuumX91491紫黄质脱环氧酶Vde1拟南芥ArabidopsisthalianaN37612紫黄质裂解酶Vp14玉米ZeamaysU95953辣椒红素/辣椒玉红素合成酶Ccs辣椒CapsicumannuumX77289β-胡萝卜素脱氢酶crtU灰色链霉菌StreptomycesgriseusX95596新黄质合成酶Nxs马铃薯SolanumtuberosumAJ272136Rose[23]等利用大肠杆菌载体pACYC184建立起三个携带欧文氏菌类胡萝卜素形成基因的质粒：pACCRT-EIB（载有crtE,B,I）、pACCAR16∆crtX（载有crtE,B,I,Y,）和pAC-CAR25∆crtX（载有crtE,B,I,Y,Z）；将它们转入JM101大肠杆菌转化体系后，分别生产出4200–500mg/gDW的番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素[24，25]。Misawa等研究发现，如果将上述质粒的GGPP合成酶基因crtE去除，它们也能生产类胡萝卜素，但产量降为原来的2－4%[26]。这一结果表明在大肠杆菌中类胡萝卜素生物合成的最终前体是GGPP，而非IPP，但大肠杆菌GGPP的含量远远低于地FPP，引入编码GGPP合成酶基因crtE增加了FPP向GGPP的转化。将pBluescriptII的lac启动子插入农杆菌类胡萝卜素形成基因crtW和crtZ中形成的基因片断，再插进pBluescriptII载体构成质粒pAK916（载有crtW）和pAK96K（载有crtW和crtZ）[27,28]；将这两个质粒分别和pAC-CAR16∆crtX或pACCAR25∆crtX.一起转入JM101大肠杆菌菌株，结果类胡萝卜素总量达到400–500μg/gDW［29］。但是，不同组合合成的类胡萝卜素不同，（pAK916和pACCAR16∆crtX）菌株只产生角黄素，而(pAK96K和pACCAR16∆crtX)或(pAK916和pACCAR25∆crtX)菌株，除积累最终产物虾青素外，还积累了从β-胡萝卜素到虾青素的一系列中间产物。这可能是CrtW和CrtZ的酶竞争同一底物的缘故[27]。然而，目前商业上生产类胡萝卜素的微生物，如杜氏藻、红球藻，产量已达到50mg/gDW［30］。虽然上述研究实现了利用大肠杆菌合成类胡萝卜素的目标，但产量仅有10－500μg/gDW，较之杜氏藻、红球藻等实在太低，因此，有必要在此基础上加以改进。Misawa等［29］设想，如果提高大肠杆菌类异戊二烯途径中IPP的产量和IPP到GGPP的转化效率，增加C源向类胡萝