DNA文库的构建(精)

第八章DNA文库的构建掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、cDNA文库构建的基本原理和操作技术；熟悉：cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成；教学目的一、基因文库某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。基因文库（genelibrary)：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。外源DNA片断、载体、宿主构建基因文库的基本程序：（1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA，（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA，（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌，（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因文库基因组DNA文库cDNA文库基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具有时空特异性。基因文库的应用：构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因二、基因组DNA文库的构建（一）基因组DNA文库的类型质粒文库，（﹤10kb)噬菌体文库，（0-23kb)粘粒文库，(~45kb)人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库，100kb—1Mb）（二）文库的代表性和随机性文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任何一段基因组DNA。一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值例：哺乳动物基因组：3×109Kbp：=99%平均插入片段大小20kbf=20Kb/3×109KbN=ln（1-p）/ln（1-f）=690773.2（三）、基因组DNA文库的构建流程①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：1．基因组DNA文库的载体制备载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。寻找最适的载体与基因组之间的比例。首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。3．文库的连接转化或包装侵染4．文库的质量检测克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。（四）、亚基因组文库例如：将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kb的Spel片段上则可将Spel酶切的基因组DNA中的8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。三、cDNA文库的构建1、cDNA文库的特征1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的发育时期或这一时期的特殊组织。根叶花花药茎穗下节幼胚GAmyb2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。3)mRNA的丰度高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22%中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49%低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%2、均一化cDNA文库通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。3、cDNA文库的构建第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；第二，第一链cDNA合成；第三，第二链cDNA合成；第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。插1）mRNA的完整性及mRNA的富集通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的完整性，间接判断mRNA的完整性。如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带，表明样品己严重降解。mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。2）第一链cDNA合成由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶，需要引物反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生完整的cDNA)3)第二链cDNA的合成氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环合成第二链cDNAS1核酸酶消化连接处自身引导法合成cDNA第二链常用方法1）它是以cDNA的第一条链为模板，设计并合成一组引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA,由于其放大的高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限的生物材料构建cDNA文库，特别适合低拷贝mRNA的克隆。2）同时，可用总mRNA作为合成cDNA第一链的模板，不用纯化mRNA，所以避免了纯化过程中某些信息分子的丢失。3）PCR合成cDNA第二链是通过在第一链3’端同聚物加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核苷酸，所以容易得到完整的cDNA。PCR合成法是构建cDNA文库的一种新策略，已得到广泛应用。优点：4、双链cDNA的分级分离连接前回收大于500bp的cDNA用于连接。去掉引物、街头及反转录产生的各种不完整的cDNA链，提高文库质量。5、双链cDNA与载体连接1）同聚物加尾：2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的接头是最常用的方法3）cDNA的定向插入：cDNA两端添加不同的限制性酶切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接末端转移酶+dCTP末端转移酶+dGTP载体和cDNA退火同聚物加尾法：CH3CH3CH3CH3CH3CH3接头加接头ds-DNA合成与SalI匹配接头相连NotI酶切1)SalI/NotI2)T4DNAligaseNotIprimer/adaptorcDNA重组子载体SalIadaptorcDNA的定向插入6、cDNA文库的载体选择一般cDNA的长度范围多在0.5-8kb之间，因此不用考虑外源片段的长度。质粒载体或噬菌体载体7、cDNA文库的均一化处理均一化cDNA文库：是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服由于基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。构建均一化cDNA文库主要有两种途径：基因组DNA饱和杂交法基于复性动力学原理的均一化学法基因组DNA饱和杂交法理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致。步骤：1）基因组DNA的酶切、固定2）基因组DNA变性成单链3）分离纯化cDNA文库的混合质粒4）文库DNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定相应的cDNA,5)洗脱cDNA并重新转化受体菌。限制：由于基因组的复杂性，很难获得覆盖基因组的单链DNA片段，导致文库内基因的丢失。理论基础：复性动力学原理cDNA文库中高丰度cDNA复性所需时间较短，低丰度cDNA复性所需时间较长，通过控制复性时间可使高丰度的cDNA复性成双链状态，而低丰度cDNA仍保持单链状态，分离单链cDNA，转化宿主细胞，即可得到均一化cDNA文库。基于复性动力学原理的均一化方法四、基因克隆的筛选策略1、表型筛选：在宿主菌中表达目的基因，使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因。(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。(2)插入失活筛选法(3)显色反应选择法(α-互补法)将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。3、菌落原位杂交法探针：1）同源DNA探针邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列设计简并探针4、免疫筛选需制备目的基因产物的抗体进行筛选。限制性核酸内切酶分析Southern杂交体外表达蛋白DNA序列分析，最准确和可靠的鉴定方法五、克隆基因的验证和分析根据载体选择保存文库的方法文库阵列法（无菌培养板）保存大片段DNA文库长期保存需在-80℃下进行避免文库的反复冻溶六、DNA文库的保存基因组DNA文库与cDNA文库的比较1）cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。2）cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。3）在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。七、目的基因的克隆基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。目的基因的克隆战略：1、构建感兴趣生物个体的基因组文库（鸟枪法克隆目的基因、cDNA法克隆目的基因）2、利用PCR扩增3、化学合成鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大；不能除去真核生物目的基因的内含子结构鸟枪法操作的改进在连接前将DNA片段进行分级分离例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。2.0kb1.6kb1.8kbcDNA法寡聚dT,32P-dNTP32P标记的cDNA探针杂交，显影寡聚dT,32P-dNTP32P标记的cDNA探针杂交，显影对照材料处理材料分离polyAmRNA分离polyAmRNA构建cDNA文库从原平板克隆中分离cDNA差示杂交筛选克隆新基因PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段的部分序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。克隆程序：A/T克隆化学合成法全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。